信号转导蛋白质分子的生物化学基础1.pptVIP

信号转导蛋白质分子的生物化学基础 一、分子组成和结构 活性肽 谷胱甘肽(glutathione, GSH) （2）分子伴侣(chaperon) （3）四级结构优越性 4.紫外吸收性质 2.丙酮沉淀与盐析 培养细胞的蛋白提取 （三）分析方法 3.免疫沉淀法 4. 电泳法分离 电泳(elctrophoresis) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向凝胶电泳 5. 层析分离 常用的层析方法 （1）离子交换层析 （2）凝胶过滤(gel filtration) 6.超速离心分离 超速离心法(ultracentrifugation) 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 常用样品蛋白质的获取 原料选择（组织、培养细胞） 前处理（细胞破碎： 物理、化学、机械） 前处理（细胞器分离） 分离纯化（选取分离方法） 1.弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整 pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂。2.在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。3.1000g，3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。 4.将A管上清21460g，1h 4 °C离心，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。对于沉淀根据需要有两种处理，A. 将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。B.将沉淀用含TritonX-100裂解液 (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。 * * CH3 丙氨酸 L-氨基酸的通式 R C + N H 3 COOˉ - H H 甘氨酸 1.分类 （1）非极性脂肪族氨基酸 （一）氨基酸 (2) 极性中性氨基酸 ★(3) 芳香族氨基酸 (4) 酸性氨基酸 (5) 碱性氨基酸 几种特殊的氨基酸 1. 脯氨酸 （亚氨基酸） CH 2 CHCOO - NH 2 + CH 2 CH 2 CH 2 CHCOO - NH 2 + CH 2 CH 2 2.甘氨酸 3.半胱氨酸 + 4.胱氨酸 二硫键 -HH - OOC - CH - CH 2 - S + NH 3 S - CH 2 - CH - COO - + NH 3 - OOC - CH - CH 2 - S + NH 3 S - CH 2 - CH - COO - + NH 3 - OOC - CH - CH 2 - SH + NH 3 - OOC - CH - CH 2 - SH + NH 3 HS - CH 2 - CH - COO - + NH 3 HS - CH 2 - CH - COO - + NH 3 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键 （二）肽键及肽 N 末端：多肽链中有游离α-氨基的一端 C 末端：多肽链中有游离α-羧基的一端 多肽链有两端： 多肽链(polypeptide chain) N末端 C末端 牛核糖核酸酶 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide) （三）蛋白质的分子结构包括: 高级结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 1.一级结构 主要的化学键: 肽键，还包括二硫键。 2.蛋白质二级结构 主要的化学键：氢键 ?-螺旋 (? -helix) ?-折叠 (?-pleated sheet) ?-转角 (?-turn) 无规卷曲 (random coil) 模体（motif） ※在蛋白质分子中，二个或二个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近形成的具有特殊功能的二级结构组合。 是具有特殊功能的超二级结构 钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构 α-螺旋-β转角（或环）-α-螺旋模体 链-β转角-α-螺旋-β转角-链模体 链-β转角-链模体 例如： 肌红蛋白 (Mb) N 端 C