木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告.docVIP

木瓜蛋白酶的分离纯化 一、目的 （1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁， 0 1 2 3 4 5 标准酪氨酸溶液 ( ml ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ ml ） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 紫外吸光度A275nm 0 0.066 0.175 0.300 0.430 0.550 将上述各管混匀，静置 2min, 测定各管的 A 275nm，做标准曲线，曲线如下： （二）粗酶活测定 1 试剂 （ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制） （ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 （ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸 （ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制 （ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液 2 方法 量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。 管号 0 （对照） 1 （样品） 2( 样品 ) 酶液（ ml ） 0.2 0.2 0.2 激活剂（ ml ） 1.8 1.8 1.8 37 度预热 10 分钟 1% 酪蛋白（ ml ） 0 1.0 1.0 37 度水浴 10 分钟 TCA （ ml ） 2.0 2.0 2.0 1% 酪蛋白（ ml ） 1.0 0 0 摇匀，静置 5 分钟过滤 OD 275nm 0.000 0.103 0.108 ? （三）纯化 固定体系总质量为20.5 g，在PEG（分子量6 000）质量分数为22.0%，(NH4)2SO4质量分数为14.6%，pH值为5.0，粗酶添加量为7.5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力 体积ml 紫外吸光度A275nm 上相 9 0.32 下相 17 0.02 （四）计算与结果 R = 9/17 = 0.529 粗酶活 = （0.103– 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.03 = 156.16 上相酶活 = （0.32 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.02 = 804.7 下相酶活 = （0.02 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.012 = 26.7 酶分配系数 = 上相酶活/下相酶活 = 804.7 / 26.7 = 30.14