原核表达实验参考手册.pdf

蛋白质纯化实验室 蛋 白 质 纯 化 实 验 室 实验手册 实 验 手 册 生物秀— 专心做生物！ 生 物 秀 — 专 心 做 生 物 ！ w w w . b b i o o . c o m 生物秀论坛-专注于生命科学！ 生 物 秀 论 坛 - 专 注 于 生 命 科 学 ！ /bbs/  w w w . b b i o o . c o m / b b s / 2007年 10月 1  第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件  1.  PCR 引物设计的基本原则 （1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 15­20。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量 宜在 45­55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。 （5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。  2.  PCR 反应组分和条件  PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有：  10×Reaction buffer，5 μl  2 个引物，各 12.5­25 pmol (终浓度各 0.25­0.50 μmol/L)  4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L  模板 DNA，100 ng左右  Taq DNA 聚合酶，2.5­3 U  PCR 反应条件一般为： （1）94℃，5分钟 （2）94℃变性 30­60 秒 （3）50­55℃退火 30­60秒 （4）70­72℃延伸 30­60秒 （5）72℃ 5 ­10分钟 共进行 25­35次循环。循环是步骤（2）和（4）  (二)  质粒 DNA 的小量制备 2  1、传统方法 （1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。 （2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集 菌体。 （3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I 中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 6­7次，然后，冰浴 5 分钟。 （4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 5­6次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。 （5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。 （6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。 （7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。DNA  沉淀 自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液  (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA,  pH 8.0)  中。  2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法­离心方案（适用于产品 A1330，  A1340，A1460及 A1470） （1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 1­10 ml过夜培养物。 （2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。 （3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 5­6 次混合。 （4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 5­6次