实验九 紫外吸收法检测DNA及浓度与纯度.pptVIP

实验九 紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度 一、实验目的 学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度，从而测出DNA的浓度与纯度。 二、实验原理 DNA的吸收峰在260nm 蛋白质的吸收峰在280nm， 1 μg/ml A260=0.02 标准DNA样品 A260=1 双链DNA含量为50 μg/ml 单链DNA与RNA含量为40 μg/ml 寡聚核苷酸的含量为30 μg/ml 纯净的DNA A260/A280的比值约为1.8 大于1.8表明样品中RNA污染严重 小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染； 纯净的RNA A260/A280的比值约为2.0，在样品中若含有蛋白质，会使A260/A280的比值下降。 三、实验材料 紫外分光光度计、比色皿、移液枪 实验八中获得的质粒DNA 四、实验步骤 ①选取合适的按键 待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA” 待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA” 待测定样品为RNA，按下键“9/RNA” 待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”。 ②将空白对照置入样品孔。 注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris溶液溶解DNA样品，则要用Tris液做空白对照。 ③按下 “Blank”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A。 ④将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度和浓度值，以及其他相关参考比值。 当A260/ A280比值1.9时，该样品可适当稀释，用饱和的酚、氯仿、异戊醇抽一次，再用无水乙醇沉淀、抽干。 当A260/ A280比值大于2时，则RNA浓度过高，要去RNA。 五、思考题 利用紫外—可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低？