琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量.pdfVIP

一．原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中，凝胶电泳由于其操作简便、快速、灵敏等优点，使它 成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。与蛋白质分子类似，核酸分子也是两性解离分子。在pH3.5 时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负 极泳动；在pH 值为8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同 大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。 所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使不同分子大小和构象不同的核酸分 子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。 1）影响泳动的四大因素： ① 影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来 说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力越大，泳动速率越小。 即泳动率与颗粒的分子大小、介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。 ② 支持物介质：DNA 的凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓 度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片断。琼脂糖的孔径大，可以分离长度 为100bp 至60kb 的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp ）的核酸。 ③ 电场强度：电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大，带电颗粒 的泳动率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时，线性DNA 分子的泳动率与电压 成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm 。 ④ 缓冲液离子强度：缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH 值、离子浓度直接影响电泳的效率。Tris ·Cl 缓冲体系中，由于Cl-的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常用TAE、TBE、TPE 三种缓冲体系。缓冲液的pH 值直接影响DNA 解离程度和电荷密度，缓冲液pH 值与核酸样品的等电点相 距越远，样品所携带电荷量越多，泳动速度越快。核酸电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件，使核酸分 子带负电荷，向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度呈反比，电泳的最适离子强度一般在0.02-0.2 之间。 2 ）指示剂 电泳过程中，常使用一种由颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚兰 ——成蓝紫色；二甲苯青——成蓝色。溴酚兰的分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同， 它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为554.6Da，携带的电荷量 比溴酚兰少，在凝胶中迁移率比溴酚兰慢，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，也有溴酚兰和二甲苯青混合应用。 指示剂一般加在上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400 或甘油以增加 比重。 3 ）染色剂 核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，这种扁平分子 可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面， 一是核酸吸收波长为260nm 的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA 分子中的EB 本身， 主要吸收波长为300nm 和360nm 的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB 发射出波长为 590nm 的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA 复合物中的EB 发出的荧光，比游离的凝胶中的EB 本身 发出的荧光强大10 倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常，在凝胶中加入终浓 度为0.5mu;g/ml 的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检 测。 由于EB 见光易分解，故应存棕色瓶中于4 ℃条件下保存。单链DNA、RNA 分子常存在自身配对的双链区， 也可以嵌入EB 分子，但嵌入量少，因而，荧光较低，其最低检测量为 0.1mu;g 。 二．材料与方法 1 材料 RNA 样品 2 仪器、用具 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、移液器等 3 试剂 (1) 1×TAE 电泳缓冲液 (2) 溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心操作] (3) 琼脂糖 (4) 6×加样缓冲液 4 方法 (1) 选择孔径大小适合的点样梳，垂直架在胶版的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5-1mm。 (2) 称取0.25g 琼脂糖，加入25ml 1×TAE 电泳缓冲液中，微波炉加热使琼脂糖溶解均匀。 (3)