基因工程制下.ppt

4 层析一般步骤： 处理介质 ↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 上样 ↓ 洗涤 ↓ 洗脱 ↓ 介质再生 * 第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中会出现质粒不稳定现象，包括分裂不稳定和结构不稳定。 质粒不稳定产生的原因： 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 2.含质粒和不含质粒菌的比生长速率差异的大小 3. 细胞中所含质粒载体的拷贝数： 拷贝数差别不大时，质粒载体相对地稳定；拷贝数相差悬殊，则很容易造成一些细胞丢失质粒，并逐渐发展为优势群体。??? 4.宿主细胞DNA重组系统的作用： 质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的程度也密切相关 5.质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培养条件有关。 1.含低拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率大，增加拷贝数能提高质粒的稳定性 2.含高拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快取代含质粒菌而成为优势菌，所以对这类菌不能简单地采取提高质粒拷贝数的方法。 高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与产物增加往往不成正比，这可能是含高拷贝质粒菌中，蛋白合成的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，使得蛋白质合成速度变慢。 质粒稳定性的分析方法： 工程菌 涂布不含抗性平板 随机挑取100个菌落 稀释 10~12h 接种 含抗性的平板 10~12h 菌落计数 提高质粒稳定性的方法： 1.两阶段培养法可有助于提高基因工程菌的稳定性 2.在培养基中加入选择压力，如抗生素，也可抑制质粒的丢失 3.采用适当的操作方法可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 一、菌体生长与能量的关系： 菌体生长由呼吸控制，各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能量决定了菌体在培养基中的最大比生长速率 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体常会产生乙酸，乙酸会对菌体的生长起抑制作用。乙酸的产生是因为供能不足，菌体将乙酰辅酶A转变为乙酰来供能。 采取各种方法，控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶A和乙酸的产生。 通过代谢工程，提高菌体摄氧能力，可减少乙酸的生成。如在大肠杆菌中表达有摄氧能力的细菌血红蛋白（VHB），可提高菌体的氧摄取能力。 减少乙酸的方法： 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，蛋白合成增加。 在同样培养基中，工程菌的生长速度低于其宿主菌的生长速度，特别是工程菌诱导后外源基因的表达一起菌体生长速率下降，甚至停止生长。 （1）前体供应不足时，会产生“严紧反应”，氨酰tRNA不足，核糖体在密码子上停留，产生调控物ppGpp，使RNA聚合酶在模板上移动产生停顿，mRNA和rRNA减少，核糖体合成减少。 （2）核糖体数量减少，则减少了氨酰tRNA的不足，减少了核糖体在肽链延长时的停顿和ppGpp的合成，在较低的比生长速率下达到平衡。 第七节 基因工程菌发酵 一、基因工程菌的培养方式 1.补料分批培养:为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长生长对数期，获得高密度菌体，间歇连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 2.连续培养：由于基因工程菌的不稳定性，连续培养很难做到。 3.透析培养：将培养基用半透膜进行透析，去除其中对菌生长有抑制的物质。 4.固定化培养：可提高质粒的稳定性 二、基因工程菌的发酵工艺 （1）培养基的组成 C源：如使用葡萄糖，则要防止对Lac操纵子的影响。 N源：常使用酪蛋白水解物，另外胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆也为常用N源。 （2）以pET载体、大肠杆菌BL21(DE3)为例，常用的发酵培养基有： LB培养基：蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：10g/L。 玉米浆培养基：玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1%。玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1%。 1.培养基的影响 2.接种量的影响：影响发酵的产量和发酵周期，接种量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因表达，采用大接种量，有利于缩短延迟期，并能减少污染。 3.温度的影响： （1）温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度下培养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外源基因表达。 （2）温度影响蛋白质的活性和包含体的形成。如表达GM-CSF的工程菌，在30度表达量最大，而在37度，由于细菌热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物被降解。表达人GH的工程菌，30度为可溶，3