实验十SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

实验十五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键打开，使蛋白质变性， SDS将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情况下，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量，即蛋白质分子的大小。因此利用SDS可测定蛋白质的分子量。 二、试剂 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存于棕色瓶中，于4℃保存。 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。 10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.5g，加水至5ml。本储存液应现配现用。 10X电极缓冲液 称取Tris 30g、甘氨酸144g，加入10%SDSl00ml，定容至1000ml。 2X样品缓冲液 称取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10% SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、β-巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 染色液 称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入甲醇450ml，冰乙酸l00ml、水650ml。 脱色液 甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水800m1. 三、操作步骤 1、分离胶的制备 (1). 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表，该配方可配制0.75mm厚、10cm X 7cm的凝胶。在配制凝胶时，将水、30％Acr和Bis储液、4X分离胶储液混合完全后，真空脱气5分钟，然后加入过硫酸胺和TEMED，立即准备灌制凝胶。 (2). 将混合液充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作过程中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。 (3). 置于室温下15-30分钟，使凝胶聚合完全 (在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝胶表面，准备灌制浓缩胶。 不同浓度凝胶的制备 2. 浓缩胶制备的方法 (1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后，立即灌胶。 (2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完全后即可拔去梳子，准备电泳。 3. 样品制备及电泳 (1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使用。 (2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验的需要加样电泳。 (3). 电泳：通常使用稳流的方式进行电泳，电流一般为18mA，时间大约3-4小时。 4、凝胶的染色与脱色 电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。小心地取出凝胶，置于染色液中染色4小时，并不时地轻轻晃动。染色完毕后，倒去染色液，用少量水淋洗凝胶，然后置于脱色液中脱色，并轻轻晃动，脱色至蓝色背景消失为止。此凝胶即可用于分析。 考马斯亮蓝检测灵敏度为0.3-1 ug/蛋白带。 银染检测灵敏度为0.1-1.0 ng/蛋白带,比考马斯亮蓝检测灵敏度高100-1000倍。 * 1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul 1.8ml 3.7ml 1.9ml 112 ul 5 ul 2.5ml 3.Oml 1.9ml 112 ul 5 ul 3.1ml 2.4ml 1.9ml 112 ul 5 ul 3.5ml 2.0ml l.9ml 112 u1 5 ul H20 30% Acr和Bis分离胶 4X缓冲液 10% 过硫酸铵 TEMED 17.5% 15％ 12.5％ 10% 8.5% 不同浓度所需的储备液体积