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第二章 基因工程载体和工具酶第二节 分子克隆工具酶 一 限制性内切酶 二 其他分子克隆工具酶 在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件 一 限制性内切酶 （一）寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 （二）限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease) 1.限制性核酸内切酶的概念 【限制性核酸内切酶】是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种具有特异性。 2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶 第一个字母（大写，斜体）：代表该酶的宿主菌属名 第二、三个字母(小写，斜体)：代表宿主菌 种名(species)。 第四个字：母代表宿主菌的株或型(strain)。 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发 现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 3.限制性核酸内切酶的分类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。 4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 【Ⅱ型限制性核酸内切酶】有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作 ◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT（二硫苏糖醇 ） 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆【1个单位限制性核酸内切酶】在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。 6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ②建立DNA分子的限制酶图谱。 ③构建基因文库。 ④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 ⑤改建质粒。 7.影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间 ②DNA样品的甲基化程度 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。 ③ 酶切反应的温度 多数标准反应温度是37℃，但