细胞传代培养-原代肝脏细胞.DOC

第一部分：细胞传代培养 1.一般客户拿到细胞后，应该注意什么？ 客户收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。 2.何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。 3.细胞何时进行传代较好？ 一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密（也就是常说的长老了），但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。 4.?贴壁细胞如何进行传代？ 去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4ml PBS洗1-2次；弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min；弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6， 1:6-1:8），每T25瓶补足培养基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培养。 5.?悬浮性细胞应如何传代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:4-1:8），每T25瓶加完全培养液至4-5ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。 6.贴壁细胞传代所使用胰酶浓度？胰酶如何处理？胰酶消化时间？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.25%trypsin-0.53mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。 7. 胰酶消化不好有何危害？如何控制胰酶消化时间？ 胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。 8.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 细胞传代或冻存时欲回收细胞，其离心速度一般为800-1000 rpm/min，室温离心5-8 分钟，转速过高，将造成细胞破裂死亡。 9.如何区分活细胞和死细胞？ 显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽， 死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。 10.如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行。 11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？?二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。? 12.细胞培养时可否使用与原先培养条件不同的培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。 我们的细胞株所使用的常规培养液都是购自Gibco 公司的，所以我们建议您