Sds-pa及ge电泳过程解析.pptx

Sds电泳培训资料培训人：刘小强1.实验目的 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定2.实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。3.实验试剂 水：当天纯化水 A液： B液： C液：1%SDS(要配置成10%的母液) D液： E液： 10%AP: F液： TEMED 染色液：考马斯亮蓝（先用50ML的乙酸溶解再加甲醇和水） 脱色液：50ML的乙酸+200ML的甲醇+250ML水 4.器材 JUNYI-1600电源 BOI-RAD电泳槽5.技术参数 250V电压 浓缩胶使用15MA电流（每块胶），分离胶使用30MA电流 电泳时间：在溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交界的地方调高电流继续电泳，等溴酚蓝跑的玻璃板底部停止。6.制胶 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干把玻璃板在灌胶支架上固定好.※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 按比例配好分离胶,用移液管快速加入 ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 7.样品处理 把样品稀释到合适浓度，按样品和样品缓冲液3:1的比例加入 MARKER 10UL水+1ULMARKER+5UL还原BAFFUR 沸水煮5分钟，离心8000RPM/5分钟，然后上样8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在塑料盒内，加入染色液，染色过夜。脱色：染色后的凝胶，弃掉染色液，加入脱色液在摇床上再脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.实验结果分析：凝胶成像系统SDS电泳过程中影响结果的因素：1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3. SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选