FACSCa及nto流式细胞仪原理.ppt

FACSCanto流式细胞仪原理及应用 陈清彬Qingbin_chen@ BD公司介绍 BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州 BD公司介绍 位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材 BD公司流式细胞仪产品 FACS Vantage SE-大型分选机 BD公司流式细胞仪产品 BD 公司流式细胞仪产品 BD FACSCanto II流式细胞仪 FACSCanto II流式细胞仪原理 流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标? 细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC） 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC） 相关的荧光强度 散射光信号的特征 FSC和SSC 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。 488nm激光激发产生散射光 散射光信号的特征 红细胞裂解的全血 荧光信号的特征 什么是荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。 荧光信号的特征 发射光的荧光强度与结合的位点成正比 信号产生 荧光信号 荧光信号的特征 常见荧光染料的发射波长 直方图显示荧光信号 点图显示荧光信号 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器； 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 FACSCanto II流式细胞仪系统组成 流式细胞仪 液流车 工作站 FACSCanto简介 配置空冷激光 两根激光:488nm、633nm、 光路固定，无需调校 液流系统 信号检测系统 八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号 电子系统将电信号转换成数字化信号 液流系统 流动室 鞘液 工作液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。 样本流 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 液流系统 鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。 检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。 在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激光激发后，样本中的颗粒被检测。 液流系统 -FLOW CELL(流动室) 液流系统 液流系统-样本流速 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 光学系统 光学系统 染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号被收集、过滤然后被检测器转换成电信号。 信号采集系统 激光 488nm，633nm， 激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号 信号检测组件-八角形和三角形 光学滤片 将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMT PMT-将光信号转换成电信号 常用荧光染料的特性 常用荧光染料(488nm,633nm激发) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素 Phycoerythrin (PE) 藻红素 Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白 Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白 Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures) FACSCantoⅡ信号检测组件 种类 八角形 三角形 构成 检测器 滤片 FACSCantoⅡ信号检测组件 八角形检测组件 FACSCantoⅡ信号检测组件 三角形检测组件 FACSCantoⅡ信号检测组件 检测器 鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。 FACSCanto 两类检测器 光电二极管：FSC 光电倍增管PMT：SSC和荧光信号 FACSCantoⅡ信号检测组件 光学滤片用于调整光谱的分布。 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。 FACSCan