小鼠海马LTP（副本）.docVIP

一．背景知识 Morris 水迷宫实验是检测动物空间学习记忆功能的重要行为学方法，海马LTP 实验可以了解突触可塑性变化，反映行为学的发生机制。脑片是指从动物脑区制备的厚度为100~700μm能够在体外存活一定的时间的脑薄片，脑片技术起始于20世纪50年代Li和McIlwain的离体脑片电生理研究。脑片兼有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点，在体外48小时内依然能保持良好的活性，离子通道性质不会发生变化，离体脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路，便于研究突触活性。在脑片的电生理过程中排除了活体血压、温度、电解质、血脑屏障等因素的干扰，可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极。 维持脑片活性有两种不同的技术：交界式脑片孵育：脑片部分浸入人工脑脊液（ACSF）中，上表面暴露在湿化的含95% O2 和5% CO2 的气体，这种孵育方式，脑片得到氧气是通过氧气在脑片上表面的扩散；全浸式脑片孵育：脑片全部浸入在人工脑脊液中，在这种孵育方式中，脑片是从溶解在人工脑脊液中得到氧气。孵育脑片方式的选用取决于实验目的。例如当采用共聚焦成像技术时采用全浸式脑片孵育。这两种不同的脑片孵育方式对脑片的细胞生理有不同的影响，例如，最近研究发现α-钙调蛋白依赖性激酶?? 的磷酸化，这种酶在LTP诱导中起关键作用，在全浸式脑片中短暂升高，而在交界式脑片孵育方式中则持续降低。脑片切片后，必须恢复1.5 小时后才开始记录，在恢复和记录过程中不一定要采用同一种孵育方式。 离体脑片上做LTP实验，周围环境容易控制，可以人为调节ACSF里面的离子成分到需要的浓度，而且可以持续给予脑片通饱和氧和二氧化碳，维持脑片的活性，还可以控制记录时候的温度，方便给予稳定浓度的药物，可控性比较好，比较适合研究急性药物对突触可塑性的影响。但是对切脑片的技术要求比较高，可以说脑片切的好不好决定实验的成败，在切脑片的时候手法很重要，当中有很多的窍门，一点做不好就会导致实验的失败。而在体实验对于动物手术的要求很高，尤其以刺激和记录电极的定位最为重要，必须严格按照图谱上的位置来放置电极，如果需要重复刺激的话还要用牙科水泥固定电极以防止脱落，术后感染和电极脱落是导致实验失败的常见原因。但是这个实验容易受到动物本身状态的影响，因为有些细胞和体液因子在离体实验中是没有的，对于海马LTP是有影响的，而且在体实验保留的神经通路和联系较离体实验更多，实验机制更复杂，也最能真实客观的反映LTP的变化，据报导在体实验中诱发的LTP可以持续几天甚至几周，而离体脑片上只能持续几个小时。 切全脑片和分离海马后再切都可以，但是如果分离海马需要经过一段时间的训练才能取的好。有的文章里面说要切断CA1和CA3之间是为了防止海马脑片从CA3传入CA1的兴奋性纤维自发电活动引起细胞的癫痫样放电，你可以把一片剃须刀片从中间折断成两片，然后取一小截刀刃，插到一根棉签木棍上来切断。 二．脑片制备方法 1.取C57小鼠，用乙醚麻醉后快速断头，切开头皮去除颅骨和硬脑膜。迅速取出全脑置于0~4℃且用95％的02和5％的C02饱和的人工脑脊液(ACSF)中稍加冷却，其成分为(mmol／L)NaCl 120，KCl 2.5，CaCl2 2.0，NaH2PO4 1.25，NaHC03 26，MgS04 2.0，葡萄糖10，氧饱和后，pH为7.4。 2.切去小脑和1／3前脑，将大脑沿正中线一分为二，由脑腹内侧沿皮质边缘分出海马，用胶水将含有海马的脑组织块固定在载物浴碟上。 3.用振动切片机冠状面切厚度为400微米的脑片。 4.将脑片放在孵育槽中浸在液面下的尼龙网上，不断充以混合气，并置于34℃恒温水浴槽中孵育0．5 h，然后置于室温(26±1)℃孵育待用，2～3 h后开始实验。 三．离体脑片电位记录 1.实验时取1个孵育后的脑片置于半浸式恒温浴槽的尼龙网上，浴槽内恒温32℃。脑片上方持续通入95％02和5％C02混合气体，脑片下方为未充氧ACSF恒速灌流（1~2mL/min）。 2.在手术显微镜直视下，将尖端裸露的双极金属钨丝刺激电极，置于CA3区Schaffer侧支路径上，刺激电极经隔离器与刺激器相连接，刺激波宽100~300μs，刺激强度0.1~0.6mA，刺激间隔2~10s。记录电极为充以4mol/LNacl的玻璃微电极，尖端直径1~1.5μm，电极阻抗2~10MΩ，记录电极经微电极放大器与记忆示波器和记录仪相接，并连接数据采集和处理系统。 3.实验时，将记录电极置于CA1区锥体细胞层，记录到的诱发电位可同时显示在记忆示波器和计算机显示屏上，进行随机或脱机处理。记录结果也可用X-Y记录仪描记