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2011～2012学年 第二学期 《细胞生物学研究方法与技术》试题 2012年5月30日 签名： 刘智高 单位： 北京大学深圳医学中心 学号： 1111110403 问答题：（10分/题） 举例说明你认为有哪些方法可鉴别细胞发生凋亡而不是坏死？ A、台盼蓝染色鉴定：坏死细胞胞膜破裂，染料能进入细胞，使细胞染成蓝色；正常细胞或者凋亡细胞胞膜完整，对台盼蓝拒染。这一方法结合电镜观察更加准确，电镜下可见凋亡细胞表面纤毛丧失，细胞核沿核膜内侧边缘开始固缩，电子密度升高等。 B、Hoechst33342、PI染色，荧光显微镜观察：两者均为仅与细胞核DNA结合的染料，荧光镜下可鉴别凋亡与死亡细胞的核变化。利用Hoechst33342-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅；凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光；而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。 C、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。坏死细胞不出现凋亡小体。 D、DNA凝胶电泳检测其片段化：凋亡细胞染色体在核酸内切酶的作用下出现核小体间有规律断裂，断裂的DNA片段约为180bp或其整数倍，这是凋亡细胞最重要的生化特征。凋亡细胞DNA凝胶电泳能观察到DNA片段组成的梯形条带，而坏死细胞DNA由于被溶酶体中DNA酶切割成连续大小的片段，在DNA凝胶上呈现为弥散模糊的条带。 E、流式细胞学检测：凋亡细胞通过DNA荧光染色，有如下流式细胞学特征：DNA特异性荧光减少，细胞浆膜完整，线粒体仍有跨膜电位，蛋白含量明显减少等。根据以上特征，Huschtscha等用碘化丙啶染色及细胞光散射的特点提出了检测凋亡细胞并与坏死细胞相区别的方法。在DNA直方图上，凋亡细胞出现二倍体峰的减少，二倍体峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。而坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图上，凋亡细胞出现低于正常的前向散射和较高的侧散射，坏死时则呈现单一的前、侧高散射。 试比较腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体的主要优缺点。 病毒载体类型优点缺点腺病毒载体在大多数组织中有相当高效的转导作用衣壳会介导很强的炎症反应逆转录病毒载体在分裂的细胞中具有持久的基因转移作用仅在分裂细胞中进行转导；在一些情况下进行融合会诱导肿瘤的产生慢病毒载体在大多数组织中具有持久的基因转移作用在一些情况下进行融合会诱导肿瘤的产生 3、软琼脂集落生成的技术路线及实验意义。 一、实验技术路线： 1琼脂制备：用双蒸水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖溶液，高压灭菌后，维持在40℃中勿令凝固。 2制备出2xDMEM（含2x抗生素和20%牛血清），过滤除菌后，保存于37℃备用。 3底层琼脂制备：按1：1混合1.2%的琼脂糖和2xDMEM后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中，待冷却凝固，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中备用。 4单细胞悬液制备：用细胞培养液制成单细胞悬液，计算细胞活率并计数后备用。 5上层琼脂制备：按1：1比例将0.7%琼脂和2xDMEM在无菌试管中混匀,总体积为3ml，再向管中加入约1000个细胞的细胞悬液,充分混匀、注入已铺有底层琼脂的平皿中，形成双琼脂层。 6待上层琼脂凝固后，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养10-14天。 7观察细胞集落。 8集落计数方法： （1） 倒置显微镜下观察、拍照并计数集落数。 （2）一般以直径60um的细胞集落为一个克隆，但根据细胞类型不同而略有差异。 （3） 统计学方法分析组间差异。 二、实验意义： 软琼脂集落生成实验是目前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，也是与细胞恶性程度最相符合的方法。是体内成瘤实验的体外实验模型,对是否具有体内成瘤性具有重要的提示作用。 简述杂交瘤方法制备单克隆抗体过程中HAT选择培养的原理。 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断D