奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术-检验检疫标准管理信息系统.DOCVIP

马秋波病毒荧光PCR检测规程 编制说明 一、任务来源 根据质检总局卫生检疫工作的需要，国家认证认可监管管理委员会《马秋波病毒荧光PCR 检测规程》列入2011年卫生检疫行业标准制定计划。本标准由中国检验检疫科学研究院、福建出入境检验检疫局、辽宁出入境检疫检疫局起草。主要起草人：姚李四、韩辉、黄恩炯、张晓龙、杨宇、曹晓梅、宋峰林、高博、徐宝梁 二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据 2．1 提出本标准的依据 沙粒病毒是一类主要由鼠携带传播的，具有强致病能力的病毒，现仅发现于美洲、欧洲和非洲。马秋波病毒一种沙粒病毒 1962年首次在玻利维亚发现，病毒由胼胝暮鼠携带30%的感染者死亡“十一五”期间将传染病防控提升到战略的角度，予以高度重视。 实时荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，灵敏度高、耗时短，还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性，是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法。 本技术是中国检验检疫科学研究院资助项目“马秋波病毒荧光PCR检测方法的建立及其应用”的研究成果，制定为行业标准。本标准设置的主要技术参数、技术内容包括：（1）样品中疑似目的病毒总RNA的提取；（2）荧光PCRPCR的操作程序；（3）PCR反应结果的判定标准。 2．3 制定本标准的基础 中国检验检疫科学研究院资助了“马秋波病毒荧光PCR检测方法的建立及其应用”课题，建立了马秋波病毒荧光 PCR检测方法，特异性强，灵敏度达到28copies/uL。 2．4 PCR试验条件 2．4．1 引物的设计 8种进化支的通用检测引物 上游引物PrimerF (5’-3’)：ACCCTCAATGATGAAWCAAAGAAAG 下游引物PrimerR(5’-3’)：AAGAGTGTGCTGCKCTGTC Probe (5’-3’)：FAM-RAATCTTCTAAGCCAGACAGTGAATGCCTY-BHQ 引物序列中的简并碱基 W表示A或T, R表示 G或 A，Y表示C或T，TaqMan探针可选择 MGB探针或 LNA探针，探针的 5’端标记的是 FAM荧光报告基团，3标记的是 MGB或 BHQI 荧光淬灭基团，探针序列中的下划线斜黑体字母表示 LNA 修饰碱基。 利用软件分析设计的引物和探针的参数 Sense Primer Anti-sense Primer Probe Sequence Sequence ACCCTCAATGATGAAWCAAAGAAAG AAGAGTGTGCTGCKCTGTC RAATCTTCTAAGCCAGACAGTGAATGCCTY Rating 72.1 79.8 77.3 Position 1096 1133 1098 Length 25 19 30 Tm 52.7 53.1 60.4 GC% 36 57.9 40 GC Clamp 2 1 3End dG -4.6 -2.3 Self Dimer dG(Internal) -3.5 -4.6 0 Hairpin dG(Internal) -0.7 -1.6 0 Hairpin Bond(Internal) 3 4 Self Dimer Bond(Internal) 4 6 3 Run/Repeat Length 3 2 2 Cross-Dimer dG(Internal) -1.1  2．4．2 组织和血清样本中病毒总RNA的提取和和cDNA合成 取研磨过的鼠肺样本或血清样本添加细胞培养液匀浆将其制成悬液，取上清细胞悬液140μL，按照Qiagen公司Viral RNA Mini Kit 说明书进行操作，用50μL DEPC水洗脱，-80℃保存。用一步法进行RT-PCR荧光检测。 2．4．3 荧光PCR程序。 本标准PCR的步骤与国外报道的资料大同小异。操作者只要严格按本标准操作，都可以获得正确的试验结果。检测结果的判定，要在分子质量标准、阳性对照、空白对照均成立的前提下才能做出。 2.4.4 研究结果 应用NanoDrop sepectrophotometer检测转录的单链RNA浓度为4709.2ng/μL，根据计算拷贝数公式[5]计算的转录的单链RNA为 2.8×1013copies/mL。对转录的单链RNA进行10倍梯度的倍比稀释，后者各取5μL作为模板进行荧光定量RT-PCR。马秋波病毒TaqMan-BHQ1探针实时荧光RT-PCR的扩增图如图1所示。结果显示，模板中马秋波病毒单链RNA拷贝数从2.8×102 copies/uL到2.8×1013 copies/uL，均得到了成功的扩增，而且具有良好的重复性，达到了制作标准曲线的要求。从