小鼠胚胎干细胞培养实验步骤.doc

细胞的原代培养 点击次数： 540? 作者：佚名 发表于：2009-03-06 16:26　转载请注明来自丁香园 ? 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养? 掌握无菌操作技术? 了解小鼠解剖操作技术? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤??了解培养细胞的消化分散? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料? 实验动物：孕鼠或新生小鼠? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇???器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。 b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。 c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。 （注意：省略了离心、计数等步骤） 一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平 皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。 二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。 `三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠 四、实验步骤： 1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。 2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。 3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。 4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML　MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。 5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。 6细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。 7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。 8 E. n8.细胞长满