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浅谈石蜡切片的制作与存在问题 摘要:石蜡切片是观察植物组织构造常用的制片方法之一。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此, 观察植物叶片结构结果显示，组织经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤后完好保存细胞原有状态，而且能清晰辨认其形态结构。 关键词：石蜡切片；组织；染色；形态结构 石蜡切片(paraffin section)石蜡制片又叫永久制片,组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。其优点主要是适合各种植物组织的制片,切片的厚薄易于控制(最薄可达015μm) ,清晰度很好,亦适合作细胞学研究,并能够制成连续切片,制片易于长久保存,易于交流等。但制片周期较长,易受条件限制,制片中使用化学试剂较多,对人有一定毒害,易使材料变脆、变硬或变形,某些内含物易于消失,常使组织变小,甚至使组织扭转变形,细胞所含物质缩小而折光性增强,影响观察正确性,且制片成本较高等。 一、植物组织制片技术的概述 植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，使人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分[1]。切片技术是生物科学工作者特别是植物学工作者常用的一种实验手段。随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用，石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中，做为基础技术提供有效的实验或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中，可对材料中被杂交的DNA 分子进行定位、含量分析或观察基因表达（mRNA）水平；聚合酶链式反应（PCR）技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA 分析，使研究进入了分子水平，但在短期内这些技术尚不能做常规使用[2]。迄今为止, 植物制片技术已建立了许多方法，多采用的有徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡切片法等[3]，其中最常规的为石蜡切片法。然而采用常规石蜡切片法包埋及染色所需的时间太长、太繁琐，有些质地过硬的材料也不宜使用。本研究同样采用此方法，并在方法上进行了一些改进，其周期短成为该法的显著特点，8-10 天即可完成整个制片过程，同时还节省了试剂[6]。 二、实验器具与试剂 2．1 器具 石蜡切片机、烘箱、切片刀、恒温展片台、蜡杯、酒盅若干、酒精灯、 蜡铲、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、台木、树胶、脸盆、包埋纸盒、吸管、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2．2 试剂 1%番红、1%固绿、各浓度的酒精（无水乙醇、95%、85%、80%、 70%、50%、30%）、FAA 固定液、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、郝普特氏粘片剂、蒸馏水、中性树胶等。 3 实验材料 选择植物健康、标准、具代表性的部分[4]。如果不是为了特别目的，不能用一些病态的不正常的材料。采下的材料应尽快浸入固定液固定。本实验采用几种针茅（Stipa.）的叶片进行石蜡制片，材料直径1mm 左右，长0.8-1.0cm。 4 实验步骤 4．1 固定 所截取得材料应迅速投入固定液。选择固定液的原则就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。因此植物材料不同，应选择不同的固定液。我们选择FAA 固定液对针茅叶片进行固定，FAA 固定液是最常用的一种固定液， 其用量最少应为所固定材料的总体积的20倍，应该使植物材料四周都能浸泡在固定液里，这样能在短时间里使固定液浸透材料。植物材料固定后，若不立即制片，可以保存在固定液中，或转至70%酒精溶液中保存[7]。 4．2 脱水及透明 将材料从固定液中取出后，进行植物材料脱水，其具体流程如下： A：酒精X：二甲苯 70%A（2h）→70%A(2h)→70%A（2h）→80%A（过夜）→85%A（2h）→95%A+伊红（2h）→100%A（1h）→100%A（1h）→1/2A+1/2X（1h）→1/2A+1/2X（1h）→X（1h）→X（1h）。设置浓度梯度是为了防止材料皱缩，但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定，对于幼嫩的材料，梯度要大些，各步浸泡时间可短些， 老的硬的梯度则要小些， 各步浸泡时间则相应要长些。第二次100％A 脱水很关键，一定要确保水脱尽。 4．3 渗蜡 将透明的材料用镊子取出放进蜡杯中， 再把碎石蜡（熔点48-50℃）用蜡铲放到蜡杯2/3 为止，加盖放入37℃温箱，放置24 h 进行溶蜡。24 小时后去掉蜡杯的盖子， 之后再将温箱温度调至56℃放置5天，使其透明剂充分挥发。取若干个酒盅将材料转移至盛有熔点为60-62℃石蜡的酒盅里，温箱温度调到70℃，2h 换一次熔点60-62℃的石蜡，