雄烯二酮产生菌的诱变选育及发酵条件优化的研究(Study on mutation breeding and optimization of fermentation conditions for producing two keto ketones).pdfVIP

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雄烯二酮产生菌的诱变选育及发酵条件优化的研究(Study on mutation breeding and optimization of fermentation conditions for producing two keto ketones)

雄烯二酮产生菌的诱变育种及发酵条件优化的研究 摘要 雄烯二酮(androstenedione )是甾体激素类原料药生产中不可替代的重要 中间体,对机体起着非常重要的调节作用,目前主要通过微生物选择性降解植 物甾醇侧链所得。微生物转化法制备雄烯二酮具有产品纯度高、不受原材料限 制、步骤简单、易于大规模生产等优点,但是也普遍存在菌种转化能力低,底 物植物甾醇在水相中溶解度低等缺点。 本文对雄烯二酮产生菌的诱变选育、检测方法、发酵工艺优化、产物的分 离纯化进行了研究探索并对产物进行了结构确证,主要完成了以下几个方面的 工作。 1. 建立了气相色谱内标法测定转化产物摩尔产率的方法,选择与产物性质 相似的胆固醇作为内标物,准确度高,克服了外标法测量结果误差较大的难题。 2.对出发菌株 Mycobacterium sp. 先后进行亚硝基胍(NTG )诱变和 N+ 注入 诱 变 , 确 定 了 最 佳 NTG 诱 变 浓 度 为 0.6mg/mL ,N+ 最 佳 注 入 剂 量 为 11 2 60×10 ions/cm 。经筛选得到一株高产突变株 Mycobacterium sp. N-2 ,当植物 甾醇添加量为 0.2% 时,产率最高达到 86.52% ,比原始菌株提高了约 37.8% 。连 续传代 7 次,生产稳定性良好。 3. 以菌株 Mycobacterium sp. N-2 为出发菌株,对其进行 NTG 诱变和基于生 长压力下的自然选育。即经 NTG 诱变后,不断提高筛选培养基中植物甾醇的 量,来逐渐增大菌株的生长压力,经筛选选育出一株耐受性较好的突变株 Mycobacterium sp. N-3 ,在植物甾醇添加量为 1%时,产物的摩尔产率能达到 61.4% ,比出发菌株提高了近 27.7% ,且传代 7 次,生产稳定性良好。 4.通过单因素实验对菌株 Mycobacterium sp. N-3 的发酵条件进行优化,确 定了其最佳培养条件为:油水相比例为 10:90 ,种龄为 60h ,接种量为 12%, 温度为 30~32 ℃,培养基初始 pH 为 7.5~8.0 ,摇床转速为 260r/min ,转化时 间为 192h,进一步提高了转化产率。 5.对产品粗提物利用硅胶柱层析和结晶方法进行分离纯化,将得到的纯度 1 13 在 97% 以上的纯化物利用 IR 、 H-NMR 、 C-NMR 、ORD 实验对其结构进行确 证,将实验结果与文献进行比对,确定产物为雄烯二酮。 关键词:雄烯二酮;诱变;分枝杆菌;优化;结构确证 Mutation Breeding of Androstenedione Producing Strain and Optimization of Fermentation Condition ABSTRACT Androstenedione, an irreplaceble intermediate in hormonal drug production, plays a conspicuous role in body regulation. It is often produced through degradation of phytosterols by microorganism. The method has several advantages such as highly purified products, unlimited raw materials, uncomplicated procedures, easily large-scale production and so on, but it also bears the disadvantages such as low yeild of product and l

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