聚合物基因载体与氧化石墨烯复合物的制备及其生物相容性的研究.pdf

中文摘要 聚合物基因载体与氧化石墨烯复合物的制备及 其生物相容性的研究 伴随着石墨烯在实验中被制备得到，人们对 2 维结构材料的认识进入新的领 域。与此同时，已被发现超过 150 年的氧化石墨，由于可以低成本大规模的被用 来制作石墨烯而重新引起了人们的注意，在此过程中由氧化石墨剥离后得到的氧 化石墨烯，由于相较石墨烯增加了许多含氧基团及缺陷而具备了与石墨烯截然不 同的性质，也同样吸引了大量科研人员对其可能的应用展开了广泛的研究。这其 中，自然不会缺少在生物医药领域中应用的尝试。现有研究已经证明，氧化石墨 烯无论在体外还是体内的毒性实验中，均表现出了良好的安全性。此外，由于其 具备极大的两亲性的比表面积，使氧化石墨烯可能达到非常高的药物负载率；而 其表面上丰富的含氧基团适合用来引入多种功能分子，使氧化石墨烯具备了成为 已知的最有效的药物载体的可能。 伴随着医学及分子生物学的不断进步，人们对疾病的认识已经开始进入基因 时代。随着人类基因组测序的完成以及相关检测手段的快速进步，包括癌症在内 的许多疾病在基因水平的发病机制被逐渐明确，这为人们提供在基因水平上对疾 病进行治疗的可能，但是，这些进步也对药物的传输方法提出了新的要求。由于 遗传物质的特殊性，决定了要有效的实现基因药物的功用，需要与传统药物完全 不同的给药手段。现有的比较成功的基因药物载体主要包含生物载体及人工合成 载体。但生物载体如病毒、细菌等存在变异复毒的风险，人工合成的载体则通常 转染率偏低，所以开发高效低毒的基因载体是基因治疗领域的研究热点之一。 在本文中，我们尝试以氧化石墨烯作为基础材料，通过对其进行化学修饰， 实现将氧化石墨烯改造成基因载体的目的。我们还通过细胞转染实验及蛋白吸附 实验初步评价了我们制备得到的复合材料做为基因载体的可行性。 I 我们首先以改进的 Hummers 法制备得到了氧化石墨烯(GO)并通过氢氧化钠 和氯乙酸对制备得到的氧化石墨烯进行了羧基化改性；为了获得具有较小尺寸的 GO，我们比较了长时间超声处理及改变中温氧化时间两种方法；为了实现载体 对 DNA 质粒的负载，我们通过偶氮化学反应，尝试将常用的两种聚合物基因载 体聚左旋赖氨酸(PLL)和聚乙烯亚胺(PEI)偶联在羧基化的 GO 上，通过投料比与 产品溶液表面电势之间的关系确定了较优的反应投料比，并通过设计吸附对比实 验证明了共价偶联的存在；在载体合成方面，我们还在小分子量 PEI 与 GO 的复 合物上进一步引入了 PEG 。在对所有复合物进行定性表征后，我们对复合物的 稳定性进行了观察，结果显示只有高分子量的PEI-GO 复合物及PEG 化的GO-PEI 复合物能在高渗 NaCl 溶液及细胞培养基中稳定存在。在载体自身性质的表征方 面，我们还观察了所有载体的 UV －vis －NIR 光谱以判断制备得到的材料是否可 能用于光热治疗。 因为已有文献报道指出高分子量的GO-PEI是一种比较有效的转染试剂，考 虑到高分子量PEI 的毒性也较高，在本文中，我们未对GO-PEI25k 复合物进行研究， 只比较了GO-PLL ，低分子量PEI 与GO复合物，及PEG化的低分子量PEI 与GO 复合物的细胞转染能力。所有测试的复合物在实验范围内均表现出了较低的细胞 毒性，同时改性后的载体样品均表现出较好的质粒结合能力。在细胞转染实验中， 我们发现三种载体材料均能实现转染，其中GO-PLL 的转染效果较差，而 GO-PEI 1.3k-PEG5k 无论在载体稳定性及转染效果方面结果均较好，通过与合成基 因载体的黄金标准PEI25k 的转染效率进行比较发现，GO-PEI 1.3k-PEG5k 具备了与 PEI25k 相当的转染效率，但毒性更低。通过近红外光照下的细胞生存率实验我们 发现高浓度的GO-PEI 1.3k-PEG5k 表现出出明显的细胞光热伤杀作用，说明这一材 料可能成为一种有效的基因光热复合治疗试剂。 最后，我们还研究了不同载体与蛋白之间的相互作用，尝试间接的评价几种 GO －聚合物复合物载体的生物相容性。选用牛血清蛋白(BSA)作为模型蛋白，我 们首先对研究方法进行了探讨，通过综合考虑实