分子标记在草坪草种质资源开发改良中应用.docVIP

分子标记在高羊茅种质资源开发改良中的应用 [摘要]:近年来，随着现代生物技术的发展，草坪草育种研究取得了明显进展，高羊茅因其抗逆性较高，根系发达，因而在草坪草资源开发利用中具有重要的地位。(F estuca arundinacea)又称苇状羊茅，隶属禾本科(Poaceae)、早熟禾亚科(Pooideae)、早熟禾(Poeae)、Bovinae亚属，是温带地区广泛应用的多年生冷季型草坪草[2]。高新技术不断地发展推动着科技进步，分子标记技术广泛的应用在不同的领域。分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记，从遗传的角度反映个体差异。他的产生突破了遗传学研究的瓶颈 ,克服了传统的形态标记 、、,具有不可比拟的优势[3]。Watson和Crick提出DNA分子结构双螺旋模型,就宣布了分子遗传学时代的到来。1974年，Grozdicker 等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA 突变体时，利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记[4]。DNA序列或蛋白质分子。DNA多态性为基础的遗传标记[5]。 DNA分子标记具有不受环境和发育阶段的影响，标记数丰富，可大大提高杂交育种的有效性和可靠性，而且在对杂种机理的认识、杂种优势的预测、目的性状的选择等方面已显示出不可比拟的优越性。1974年等创立了限制性片段长度多态性（）技术，它是一种以southern第一代遗传标记。RFLPDNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造成酶切位点问的长度发生变化等均可导致RFLP的产生[6]。然后通过电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用克隆DNA探针与膜上变性DNA杂交，放射显影，获得反映个体特异性的图谱RFLP标记呈共显性标记。由于该技术操作步骤繁杂、成本高、耗时长、工作量大，且DNA的需要量大，在很大程度上限制了RFLP技术的推广和应用[7]。在研究中，尽管RFLP的利用有着非常重要的作用，但进行RFLP标记先得对DNA序列有足够的了解，才能够准确地制作探针。 VNTR标记 VNTR（Variable number of tandem repeats）即DNA可变串联重复数标记[8]。真核生物基因组中存在着卫星DNA序列（短的传来女重复序列），VNTR与RFLP的原理相似，不同之处在于限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性，但是在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可以使卫星序列所在的片段含有较少无关序列。由于小卫星和微卫星可分布于整个基因组的不同位置上的特点，其重复数及仇富程度于存在着很大的变化，在群体中表现出高的多态性，另外该技术没有组织特异性，使得结果稳定可靠。 （二）以PCR为基础的分子标记 1.AFLP标记 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）即扩增片段长度多态性。AFLP是1995年荷兰科学家Zabeau和Vos等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生大小不等的DNA 片段，使用双链人工接头（adapter）与该酶切片段相连接作为扩增反应的模板，在DNA聚合酶的作用下进行PCR反应。在事先不知道DNA序列信息的前提下，就可对酶切片段进行传统的扩增。它结合了RFLP的可靠性和严格的PCR退火条件，有高度特异性，既克服了RFLP技术中Southern杂交的烦琐和耗时的缺点，又解决了RAPD等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题[9]。但是由于AFLP技术过程复杂，涉及到DNA限制性内切酶的酶切、接头的连接、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析等诸多步骤，试验过程中不论哪个环节出现问题，都不会得到理想的结果。 2.RAPD标记 RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA）即随机扩增多态DNA。是由 Williams和Welsh等两个研究小组同时发现的一种建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记的技术。由于其简单易行、周期短、标记位点数量多和引物通用性强等特点,已被广泛应用于物种起源进化、群体遗传结构分析和标记辅助选择等领域。然而RAPD易受实验条件影响，稳定性和重复性差等缺点在很大程度上淡化了RAPD的应用前景[10]。随着RAPD日益广泛的使用，其不足之处也逐渐显现，，，，，[11]等问题。PCR为基础的分子标记技术[12]。SSR具有检测快速、信息量大；高度变异性；遗传方式简单稳定；所需DNA量少，即便降解了也能有效地分析鉴定的优点。但是SSR分子标记也存在缺