利用酿酒酵母表达重组人白蛋白—甲状旁腺激素1-34(ab)二联体蛋白.pdfVIP

独 创 性 声 明 摘 要 摘 要 人甲状旁腺激素(Human Parathyroid hormone, hPTH)是一个有 84 氨基酸的单链多肽 激素，可以通过调节钙离子在体内的平衡直接作用于肾脏和肝脏。临床研究表明甲状旁 腺素 N 端的 1-34 个氨基酸是一种骨合成代谢剂，能够恢复骨矿物质密度，对 hPTH(1-34) 的研制是生物制药的一个热点。人血清白蛋白(HSA)与 hPTH(1-34)二联体(PTH(1-34)ab) 融合，可以有效延长 PTH 在体内的半衰期，然而，通常毕赤酵母表达融合蛋白 hPTH(1-34)ab-HSA 会发生 N 端随机丢失现象，影响融合蛋白的表达质量。为了解决这 一问题，本文利用酿酒酵母进行完整表达 hPTH(1-34)ab-HSA 的探索。 为构建酿酒酵母 hPTH(1-34)ab-HSA 表达质粒，本研究通过设计特异性引物，利用 重叠 PCR 技术，将 α-Factor 信号肽基因与 hPTH(1-34)ab-HSA 基因融合，得到 α-hPTH(1-34)ab-HSA 基因片段，并插入到 pYX212 质粒中，得到 pYX212-α-hPTH(1-34)ab- HSA 重组质粒，测序表明质粒构建完成。通过 LiAc 转化法将重组表达质粒 pYX212-α- hPTH(1-34)ab-HSA 转化 S. cerevisiae W303- 1A，利用缺乏尿嘧啶的 SC 培养基筛选重组 菌，并利用菌落鉴定得到阳性转化子，利用 Western blot 鉴定表达产物。结果表明，酿 酒酵母表达的融合蛋白 hPTH(1-34)ab-HSA 具有很好的 HSA 和 hPTH 抗原性。 为了探索提高融合蛋白产量的途径，将质粒原有的 TPI 组成型启动子替换成 GAL1 诱导型启动子，结果表明，诱导型启动子可以提高融合蛋白的产量 10%左右，但从生产 周期，以及节约成本等方面综合考虑，组成型 TPI 启动子的重组菌略占优势。 为有效的检测融合蛋白的表达完整性，将 6 ×His 标签插入 hPTH(1-34)ab-HSA 基因 与 α-Factor 信号肽基因之间的 EcoR I 酶切位点，构建带有组氨酸标签的重组质粒 pYX212-α-HIS-hPTH(1-34)ab-HSA 。将带有组氨酸标签的重组质粒 pYX212-α-HIS- hPTH(1-34)ab-HSA 转化 S. cerevisiae W303- 1A，Western blot 鉴定表达产物显示，融合蛋 白 HIS-hPTH(1-34)ab-HSA 具有良好的 HIS 、HSA 和 hPTH 抗原性，表明融合蛋白 hPTH(1-34)ab-HSA 的 N 端表达完整。工程菌表达结果表明，与毕赤酵母表达相比，利 用酿酒酵母可以完整表达 hPTH(1-34)ab-HSA 。 通过对摇瓶条件进行初步发酵优化，确定为：接种量 10%，葡萄糖浓度为 30 g/L， 酵母粉 12 g/L，装液量 30 mL/250 mL，温度 30 ºC ，pH 6，转速200 r/min，表达量可达 到 8.11 mg/L，比优化之前提高了23%左右。 关键词：酿酒酵母；融合蛋白；hPTH(1-34)ab-HSA；稳定表达；完整表达 I Abstract Abstract Human Parathyroid hormone (hPTH) is an 84-amino-acid polypeptide that acts as the most important regulator of calcium homeostasis in the human body through its direct action on bone and kidney. Clinical studies have demonstrated that hPTH(1-34)