白细胞介素24的生物制备、纯化及初步药效学分析.pdf

摘 要 摘 要 白细胞介素24 （IL-24 ）自20 世纪90 年代中期被发现以来，因其在抗肿瘤方面所 表现出的特性，引起国内外众多学者的关注。 本文将已构建的含有目的基因 IL-24 的表达质粒 pET21a(+)/IL-24 ，导入大肠杆菌 BL21 构建工程菌，并使用大肠杆菌原核表达系统对 IL-24 进行发酵表达，建立了一套 IL-24 相关的高密度发酵、产物纯化工艺和复性工艺方法。工程菌经5 L 发酵罐 30 ℃、 1 mmol/L IPTG 诱导发酵10 h，获得菌体湿重186.32 g，单位体积目的蛋白的表达量达 到1800 mg/L 。 发酵结束后，菌体经离心、高压破碎获得IL-24 包涵体蛋白，包涵体蛋白经洗涤、 Q sepharose 和SP sepharose 离子交换层析，可得到纯度大于95%的IL-24 蛋白，纯化总 回收率约为20% 。SDS检测其分子量约为 18.5 kD，Western blot 杂交以兔抗人 IL-24 单克隆抗体作为一抗，以HRP 酶标抗体（羊抗兔）作为二抗，以DAB 为底物进 行显色反应，结果显示所获得的目的蛋白为IL-24 。 将纯化后的IL-24 变性溶解，并通过原复性方案 （苏州大学提供的复性方案）、梯度 复性方案、2DR 法复性方案等进行复性，采用 B16 细胞作为活性检测细胞株对复性后 的 IL-24 蛋白进行活性测定，各复性方案的半数抑制浓度分别为 3.67 μmol/L、2.03 μmol/L、2.56 μmol/L，结果显示最佳复性方案为梯度复性方案。同时，对梯度复性所得 的 IL-24 做进一步的肿瘤细胞生长抑制实验和诱导肿瘤细胞凋亡的实验，MTT 法检测 IL-24 对肿瘤细胞的生长抑制，其中当IL-24 浓度为90 μg/mL 时，IL-24 对B16 细胞的 生长抑制率达76%，流式细胞仪检测B16 的凋亡情况，凋亡率为45.3% ，与对照组差 异具有统计学意义(P=0.00180.01) 。此外在进行IL-24 体外活性评价过程中还发现B16 细胞为IL-24 的敏感细胞株，为以后IL-24 活性评价细胞株的选择，提供了参考。 关键词：白细胞介素24 ；表达；纯化；活性评价 I Abstract Abstract Interleukin 24 (IL-24) was dicovered in mid 1990s, which held a great promise on therapeutic application owing to its anti-cancer properties. In this paper, the successful constructed plasmid pET21a (+)/IL-24 was transformed into BL21 (DL3) forming E. coli expression system. Through a series of processes including high cells density fermentation, purification and refolding process, we obtained high bioactivity target protein. The amount of IL-24 could reach 1800 mg/L using 5 L fermenter after 1mmol/L IPTG induction for 10 h at 30 ℃. Using washing