树脂型pcr产物纯化及胶回收试剂盒操作方法.docVIP

树脂型PCR产物纯化及胶回收试剂盒 操作方法PCR产物 0.4ml纯化树脂（50~100μl无石蜡油的PCR反应液颠倒混匀3分钟。13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 加入500μl 80%异丙醇或乙醇，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 2步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇或乙醇除尽。如果纯化柱上还残留有异丙醇或乙醇，,000rpm再离心1分钟 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，加入50μl TE缓冲液若用于测序，则加50μl超纯水于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。 离心管中的液体即是纯化的PCR产物，取4μl电泳0.8%琼脂糖，120V，10分钟检测并目测定量。二从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段 将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液50μl~100μl反应体系在1%的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条带装入2ml离心管中。 200mg~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂（70℃保温510分钟，每两分钟颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。 2%），每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂，加热融15分钟。 将混和液入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 加入500μl 80%异丙醇或乙醇，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇或乙醇除尽。如果纯化柱上还残留有异丙醇或乙醇，13,000rpm再离心1分钟 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，加入40μl TE缓冲液若用于测序，则加40μl超纯水于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。 离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4μl电泳0.8%琼脂糖，120V，10分钟检测并目测定量。 常见问题 可能原因 参考意见 回收率低 琼脂糖胶块未完全融化 尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶 400μl的纯化树脂中不要超过400mg琼脂糖凝胶 增加温育时间至15分钟，每2分钟混匀一次 琼脂糖凝胶浓度过高 配制0.8%~1.0%的琼脂糖凝胶进行回收 某些琼脂糖凝胶不容易被融化 更换琼脂糖，情况可能会变好 纯化树脂（于GS结合液中）有结晶出现 将纯化树脂（于GS结合液中）置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀 洗脱温度过低 加入无菌超纯水或TE浸透树脂后，于37℃温育2分钟 回收片段过大或过小 最适宜的回收片段为200bp~5Kb 回收的DNA片段在后续实验中出现问题（例如连接失败） 盐的浓度过高 用80%乙醇漂洗回收产物 增加漂洗次数 残留有有机试剂 增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净 EB染色须在紫外线下切胶，紫外线的照射损伤了DNA片段 在长波紫外线下切胶 尽量缩短切胶时间 建议用其它DNA染料代替EB（例如GoodView?染料），在自然光下切胶 在胶里和电泳缓冲液中加入DNA紫外防护剂 部分双链DNA变性为单链DNA 在进行后续酶反应时，加入除酶以外的其它成份，通过95℃ 2分钟，再缓慢冷却至室温（25℃以下），使单链DNA重新退火为双链DNA，然后加入酶，继续进行酶反应 用含有10mM NaCl的Tris Buffer洗脱DNA片段。（注意：盐的浓度可能影响后续实验） DNA片段易降解 DNA在酸性环境中脱嘌呤 用pH7.0的无菌超纯水或TE洗脱；若非用于测序，最好用TE