推荐02 组织制备.pptVIP

2. CO2冰冻切片和半导体冷冻切片: 用CO2直接喷射或半导体制冷1~2分, 将切片刀和5mm3左右的组织全部冻结至-60~-70℃后切片(10~40?m). 3. 注意问题: a. 骤冷: 速度要快(1~10℃/S)以免组织内形成冰晶破坏微细结构. b. 冷冻保护: 甘油, 蔗糖, 甘露糖(Seminose), 二甲亚砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)和聚乙烯砒咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)等, 避免骤冷损伤组织微细结构. 常用OCT冷冻液覆盖组织后液氮直接骤冷(-190℃)20秒. c. 组织可预固定: 未固定酶保存充分, 但易造成移位, 固定对酶活性有损伤. 福尔马林钙液4℃18小时可防止酶类和其它物质的破坏, 移位和扩散, 水洗后入4℃冷冻保护液(明胶-蔗糖液)数小时, 液氮骤冷或恒冷箱制冷并切片, 并粘附在2%明胶-甲醛处理的玻片上. d. 温度: 多数组织在-15~ -20℃切片. 温度过低或组织过硬易造成切片卷曲或破碎; 温度过高或组织太软易造成切片皱褶或融化粘附在刀上. e. 切片刀: 调整刀对组织的角度一般新刀为20?. 降低刀口温度可切出较薄连续切片. 5. 后处理: 选择使用. a. 将切片贴在温(室温)或冷(冷箱温度)的玻片, 融化时固定(如甲醛, 戊二醛, 丙酮和OsO4蒸气) 或入冷保护剂. b. 贴于温或冷的玻片, 融化, 空气干燥, 后固定. c. 移入组化孵育液中(如脑切片等). D. 振动切片法: 可用于新鲜组织非冰冻切片. 酶组化和免疫组化常要新鲜组织(不冰冻, 不固定)切片(10~200?m). Sorrall Tc-2组织切片机能连续切片, 但切未固定组织时切片厚100?m以上. Oxford震动切片机依靠刀的振动进行切片. VI. 切片附贴(Adhesion), 染色和封固 A. 附贴和粘附剂: 使切片牢固粘贴在玻片上. 1. 蛋白甘油液: 最常用. 蛋清(不要蛋黄和系带)搅匀去泡沫, 加等量甘油(Glycerol)搅匀, 麝香草酚(Thymol)防腐. 也可用2:1蛋白甘油液. 2. 铬矾明胶(Chromic alum gelatin)液: 粘着牢固不被染色, 不受酸碱影响. 明胶0.5~1%, 铬明矾0.05%, DDH2O配置后过滤, 麝香草酚防腐. 3. 冰冻脑切片附贴剂: DDH2O 200ml, 氯化钠3.6g, 明胶4g, 无水酒精200ml. 氯化钠和明胶在水中加热溶解, 加纯酒精后煮沸1~2分, 冷却. 载玻片浸入粘附剂数分, 取出自然干燥或烤干待用. 4. 多聚赖氨酸(Polylysine): 0.01%, 多聚赖氨酸带正电荷, 组织切片带负电荷. B. 染色: (略). C. 封固和封固剂: 便于观察并长期保存染色结果. 1. 湿性封固剂: 不经脱水透明即可封固, 保存时间短. a. 纯甘油: 折光率低, 不利于染色结果观察. b. 甘油明胶: DDH2O加热稀释明胶后, 加适量甘油. 用时加温溶化. 折光率较高. c. 聚乙稀醇: DDH2O稀释, 煮沸, 加适量甘油, 用前入37℃温箱溶化. 2. 干性封固剂: 切片经脱水透明后才能封固, 可长期保存. a. 中性树胶: 最常用. b. 加拿大树胶: 可溶于二甲苯, 但不耐热且易挥发. c. DPX封固剂: 迪士春80(Distrene80)10g, 酞酸二丁酯5ml, 二甲苯35ml. 中性封固剂, 组织收缩严重. 组织切片制备基本过程 VII. 组织制备常见问题 A. 固定不及时彻底. B. 切片不洁净. C. 切片刀不锋利. D. 裱片不平展, 粘附不牢靠. E. 脱水或透明不彻底. F. 染色不均匀或褪色迅速. 第二章. 组织制备 (Tissue preparation) 基本原理和步骤同组织学, 包括取材, 固定, 洗涤, 脱水, 透明, 包埋, 切片, 组化和免疫组化反应, 封固和观察等. I. 取材: 材料新鲜, 器材洁净锐利, 部位准确. LM: 0.5cm3, EM: 1mm3. 3分内入(4℃)固定液. II. 固定(Fixation) A. 目的: 用固定剂(Fixative)和组织内的蛋白质反应, 使组织持久保存于接近存活时的代谢状态, 并耐受后续处理. B. 固定剂的作用: 1. 阻止溶解和损伤: 稳定蛋白骨架, 进而阻止其他物质的溶解. 2. 防止腐败和自溶: 抑制内外源性酶, 并改变组织成分的化学性质以耐受酶解. 3. 增强染色: 改变折光率, 促进染色(如苦味酸可增强酸性品红对胶原纤维的着色, 用于Van Gieson染色法中). C. 固定剂特点: 1