973项目、国家自然科学基金项目申请书_基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法.doc

项目名称： 基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法 首席科学家： 谭蔚泓 湖南大学 起止年限： 2011.1 至 2015.8 依托部门： 教育部 二、预期目标 总体目标: 本项目针对当前蛋白质研究中存在的瓶颈问题，发展基于核酸适配体的蛋白 质研究新技术新方法；以肝癌和食管癌为研究对象，面向我国社会发展中提高人 类健康的重大需求，通过建立肝癌和食管癌相关蛋白的发现、分离分析、检测表 征等新技术，探索肝癌和食管癌发生发展的分子机制，为恶性肿瘤等重大疾病早 期诊断提供新技术和新方法。通过开展多学科交叉与综合研究，形成具有原始创 新的方法学突破及自主知识产权的蛋白质研究支撑平台，获得具有国际影响的重 要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍，促进我 国在蛋白质研究领域达到国际领先水平。 五年预期目标： 1. 阐明核酸适配体筛选过程的进化规律，建立针对蛋白质、细胞、组织等 不同层次蛋白质靶标体系的高效率核酸适配体筛选技术平台，并筛选出针对肝癌 和食管癌特异性标志物的核酸适配体15-30种。 2．揭示核酸适配体与蛋白质相互作用的分子机制，发展2-4种具有自主知识 产权的系统研究核酸适配体分子识别的方法，为核酸适配体分子探针的设计、筛 选、构/效关系和性能评价提供理论指导。 3. 发展高灵敏、高通量、高准确度的蛋白质定量检测的新原理、新方法， 提出高效率、高重现性的蛋白质分离富集的新方法、新技术，研制出相应高通量、 自动化的蛋白质分离及检测系统，对低丰度蛋白检测的灵敏度达到1 pg/mL及更 低水平，为肿瘤的蛋白质生物标志物的发现、重大疾病的分子机制研究与早期诊 断提供研究工具。 4. 建立肝癌、食管癌等恶性肿瘤体系的特征核酸适配体分子识别指纹图谱， 发现4-5种特异性高的癌症标志物，并完成核酸适配体分子识别体系在癌症早期 诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。 5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和 新方法。发表一批高水平、具有重要国际影响的学术论文。申请并获得一批具有 产业化前景的发明专利。 6. 在蛋白质研究领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的优 秀人才队伍与中青年研究骨干。通过项目协作，促进形成一支在核酸适配体相关 领域具有国际领先水平的学术团队。 三、研究方案 （一）总体思路 （1）以肿瘤为研究模型，发展基于核酸适配体的蛋白质研究技术 本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重 大战略需求出发，以2008年度起蛋白质研究重大计划重要支持方向“蛋白质研究 的新技术和新方法” ——“核酸适配体识别等新技术新方法”为依据，发挥核酸适 配体所具备的高特异性、高亲和力、高稳定性、便于化学修饰与功能化、易于大 量低成本与可重复性合成等优势，以及可通过核酸适配体筛选发现未知蛋白标志 物并获得病变体系特征分子图谱的优越性，开展核酸适配体分子识别基础研究， 指导蛋白质分离与检测方法的设计与发展，建立高通量、高灵敏、高准确度的蛋 白质研究新方法和新技术，为癌症早期诊断提供特异性蛋白质标志物、分子探针、 分子识别传感器件，满足提升我国人民健康水平的需求。 （2）通过学科交叉，发展癌症早期诊治新方法 随着核酸适配体、纳米生物探针、蛋白质组学研究方法的发展和成熟, 核酸 适配体技术在恶性肿瘤等重大疾病诊治方面的应用正面临新的机遇。利用我们在 核酸适配体分子识别体系基础研究和蛋白质研究技术创新方面的优势，通过多学 科交叉, 联合国内的优势单位组成跨学科的研究团队（包括化学、生物医学、蛋 白质科学、纳米技术等学科），系统地开展基于核酸适配体的重大疾病蛋白质标 志物发现与检测技术的基础研究，利用核酸适配体分子识别体系进行癌症等重大 疾病的早期诊断，将核酸适配体分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现 实。 （二）技术路线： （1）核酸适配体筛选方法研究： 构建大容量（1013至1015）的DNA和RNA分子文库，通过对核苷的2’位修饰 或对磷酸骨架进行硫代修饰等，改善文库的生物稳定性。优化筛选条件与流程。 对于已知的几种肝癌和食道癌相关蛋白质（如AFP、PIVKA-II、P53 Ab），采用体 外表达纯化的蛋白质直接进行筛选，通过系统优化筛选压力，获得特异性高和亲 和力强的核酸适配体；同时为了发现未知蛋白质标志物，以肝癌和食道癌细胞、 癌组织作为正筛选靶标，甄别对应非癌细胞系、癌旁组织等做阴性对照进行反向 筛选，优化筛选条件与流程。对筛选出的核酸适配体进行测序、二级结构模拟分 析、序列裁减，并表征其与靶标结合的亲和力和特异性。通过针对大量不同样本 的系统筛选，发现核酸适配体筛选过程中的进化规律，建立高效、快速、标准化 的筛选方法。 （2）核酸