胡萝卜201拟3愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导1.pptVIP

胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和胡萝卜愈伤组织再分化的诱导 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法和相关操作。 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培养技术生产有用次生代谢物这一个技术的主要流程，技术体系和注意事项。 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和方法。 植物细胞的悬浮培养 胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂，细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以诱导疏松性愈伤组织的产生。 利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块，可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养体系，并在此基础之上进行培养物的继代和保持，进行有用次生代谢物的生产。 愈伤组织再分化的诱导 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L 培养条件： ？ 三 实验操作 1.悬浮培养体系的建立 做今天实验之前: ?前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反应的观察 ?植物细胞工程实验部分实验报告的撰写 生长反应 具体操作： 8人/组 2瓶悬浮培养基/组 约1g 细胞/瓶 3 胡萝卜素的分离提取和含量测定 悬浮细胞的收集 悬浮细胞的收集 甲醇萃取 β-胡萝卜素 乙醚纯化 含量的测定 己烷中的β-胡萝卜素在波长452nm下的摩尔消光系数ε1cm1%=2500，即溶液的OD452为0.25时每ml含β-胡萝卜素1μg。 * 一、实验目的 二、实验原理 由固体培养转向液体培养，对细胞而言有什么差别？ 细胞悬浮培养的目的和所需要的条件？ 一个好的培养体系具备什么样的特征？ 愈伤诱导 外植体 愈伤继代 单细胞或细胞细胞团块的获得 液体培养 无菌 脱分化 细胞分裂、分化调节 方法（机械和酶法） 细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.5mg/L 观察 拍照 分析 有污染 无污染 污染源: 细菌,霉菌?现象? 原因: 外植体?环境?操作? 不生长,发白或死亡 愈伤形成 不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位 颜色质地 差异原因? 实验报告 形式 内容 文字 图片 数据 分析讨论 综合性的一篇论文 分开的三次实验报告 不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片 结构上的完整性 术语的正确使用 存活率 污染率 污染原因的分析 实验结果的分析 思考和讨论 选择疏松性愈伤组织 称重,计算细胞鲜重的增加(?g ) 无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开 接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重,获得细胞的鲜重(1g 左右) 单细胞或小细胞团块 悬浮振荡培养1周或更长 收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量 1.悬浮培养 2. 再分化诱导 8人/组 2-3瓶/人 建立起来的无菌培养物 无菌条件下切割分开 接种在分化培养基上 适当条件下培养1-3周 培养反应的观察 甲醇萃取 β-胡萝卜素 乙醚纯化 β-胡萝卜素 β-胡萝卜素含量的测定 用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞 待溶液完全过滤后称纱布/滤纸和细胞的重量 将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布/滤纸重量 计算细胞鲜重 每克试样加10ml含10%KOH的甲醇溶液 水浴上加热(64.8度以上)避光回流30min 将收集好的细胞放入圆底烧瓶中 去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液 上清液（约10ml）放入分液漏斗 加入150ml乙醚振荡摇匀，静止分层 倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚， 残留物用4-5ml己烷溶解 在波长452nm下测定吸光值A452。 *