大肠杆菌高活与性氨基酸生物合成途经研究.docVIP

研究目的： 汽油替代品：高能量密度、低吸湿性、辛烷值 传统生物燃料高级醇；直链醇支链醇 研究菌体：大肠杆菌 方法技术： 代谢工程：高活性氨基酸生物合成途经+埃利希途径（Ehrlich pathway） 葡萄糖→2-酮酸中间体→高级醇（异丁醇、1-丁醇、2 -甲基- 1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇） 实验部分： 一、异丁醇 前期实验： 1）2-酮酸是氨基酸生物合成途径的中间产物；通过2-酮基酸脱羧酶（KDC）转化为醛；通过醇脱氢酶（ADH）转化为醇类。通过实验，测定Kivd是所有测试酶中活性最高且最具有多样性的KDC，ADH选用乙醇脱氢酶2，二者均来自酵母菌。 2）不同种类的2-酮酸（表2）加入到表达Kivd的大肠杆菌培养菌中会将相应醇类的产量提高2~23倍。特种2-酮酸的供应也明显地削减了其他醇类的产量。这些结果均表明增加特种2-酮酸的量可以提高醇类的产量和选择性。 大肠杆菌已有的代谢途径被转基因改造，增加特种2-酮酸的产量，可以生产出期望的醇类。 设计菌株： 1）为合成异丁醇，质粒内PLlacO1启动子控制的ilvIHCD基因被过度表达以增大2-酮异戊酸生物合成量。 2）强化ilv合成途径和乙醇合成途径（Kivd 和Adh2）。 菌株可产生出23 mM异丁醇，这约是普通菌株产量的五倍 3）进一步提高异丁醇的产量，需要删除控制合成副产物的基因，包括adhE，ldhA，fr