动物细胞工程试验讲义(学生版).docVIP

实验一 细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌 体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。 实验目的 掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。 实验原理 清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆 盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。 消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。通常用化学方法来达到消毒的作用。 灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。 3．实验准备 仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。 实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。 主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。 4．试验方法 4.1 玻璃器皿的清洗 （1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。新使用的器皿，用清水冲洗后放入盐酸溶液（5%）中浸泡过夜。（盐酸浸泡主要是为了中和其中的碱性物质。） （2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷蘸洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。（刷洗次数太多，会损害器皿表面光泽度，所以要选择软毛刷，切不可使用含沙粒的去污粉。） （3）浸酸：刷洗不掉的极微量杂质要用硫酸和重铬酸钾清洗液浸泡，它们经过强氧化作用后，可被除掉。（清洗液具有腐蚀性，使用时要带耐酸性手套。新配制的清洗液为棕红色，遇有机溶剂或水分增加时变成绿色，表明其失效。浸泡时，放入器皿要缓慢，防止发生迸溅。器皿要充满清洁液，浸泡时间不应少于6h,一般浸泡过夜。） （4）冲洗：将经过上述步骤处理的玻璃器皿用清水冲洗5-10遍，放入蒸馏水中漂洗3-5遍。控干，用牛皮纸包好。然后置于干燥箱中，50度烤干，备用。（流水清洗时水流应保持不断，每次应将水灌满器皿并倒干净，以去除残余的洗涤剂。干燥器皿时不要摆放过紧，以免阻碍热空气的流通。） 4.2 塑料制品的清洗 （1）器皿用后立即用流水冲洗或浸泡于自来水中过夜。 （2）用2%NaOH溶液或含NaClO的蒸馏水浸泡过夜。 （3）然后用自来水冲洗，如用NaOH溶液浸泡的，还需再用5%盐酸浸泡15-30min。（如果残留附着物，可用纱布或棉签刷洗。） （4）用盛有50-60度蒸馏水的超声波仪，超声波清洗30min。 （5）用蒸馏水冲洗3-5遍，放入烘箱中50度烤干，备用。 4.3手术器械的清洗 手术器械等用酒精棉球擦拭干净，确保器械上面没有污染物，装入铝制饭盒中，用报纸包裹好。 4.4高压蒸汽灭菌 将所有清洗干净的玻璃器皿、塑料制品以及手术器械包裹好放入高压灭菌锅中，常用灭菌条件为压力0.15MPa,温度121度，15-30min。（蒸汽温度达到121度，能将耐热的芽孢在30min内全部杀死。灭菌时，消毒物品不能装得过满，以保证锅内气体流通。） 4.5无菌培养室的消毒 （1）用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次（拖布要专用），然后打开紫外灯照射消毒30-50min.（2）用75%乙醇擦洗超净工作台台面，然后用紫外灯消毒30min。 （3）在无菌环境下进行培养或做其他无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管冒、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 5． 注意事项与建议 消毒时超净工作台台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡紫外线，降低消毒效果。 金属器械不能再外焰中烧得时间过长，以防金属退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。 湿热灭菌后的器皿应在干燥箱中60°C烘干，待器皿完全干燥并经75%乙醇喷洒消毒后再移到无菌操作间使用。 吸取营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因为残留在吸管头中的营养液