土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定实验.docVIP

广 州 大 学 综合设计性实验报告 学 院 生 命 科 学 学 院 课 程 微 生 物 学 实 验 实验项目 实验八 综合实验 实验题目 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 及其淀粉酶活力的测定 专 业 生物工程 班 别 生物工程 姓 名 同组人员 学 号 指导老师 完成日期 土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定实验 摘要：从土壤中运用梯度稀释的方法分离培养出不同生长形态的细菌，挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各种生化试验鉴定出菌株的生长特性，进而鉴定菌株的特性，确定其具体学名。 关键词： 单染色 革兰氏染色 酶活力测定 生化试验 稀释涂布 前言: 芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，为好氧或兼性厌氧的杆菌，一般为革兰氏染色阳性能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。在某种环境下，菌体内的结构发生变化，经过前孢子阶段，形成一个完整的芽孢。芽孢对热、放射线和化学物质等有很强的抵抗力。在化学组成方面，在芽孢内含有大量营养细胞中不存在的二吡啶羧酸的钙盐；在结构方面，芽孢的原生质外围有三层膜，从内到外是厚的皮层（cortex）、孢子壳和孢子外膜。在芽孢杆菌属中，对种的划分是以菌体的大小、孢子的形状及其在菌体内的位置、糖的利用及其产物、能否还原硝酸，以及在高浓度的食盐条件下能否生长等为依据。广泛分布在水、空气和土壤中。代表种是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌。英语bacillus一词，也可作杆菌或整个芽孢细菌的通称。Lugol）碘液、95%乙醇、0.5%沙黄染色液或番红染色液 芽孢染色：5%孔雀绿溶液、石炭酸复红液、香柏油、二甲苯及擦镜纸 吲哚试验：乙醚、吲哚试剂 V.P试验：40%KOH(或NaOH)溶液、5%α-萘酚溶液 3.2 实验器材 无菌玻璃涂棒、无菌移液枪、无菌枪头、接种环、接种针、无菌培养皿(9cm)、三角瓶 锥形瓶、烧杯、洗瓶、玻璃棒、试管、酒精灯、擦镜纸、吸水纸等 恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、磁力搅拌器、显微镜 四、实验方法及步骤 4.1土样采集： 在我校广州大学取采样点，生化楼楼下河边的绿化带，用无菌用具，如用酒精擦拭过的铲子去除表面土层，取其各自表土10cm左右的深处土壤，装进无菌防水袋，编号包装好。 4.2.梯度稀释法制土壤悬液 4.1.1土样取5g，放入装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。 4.2.2将锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液 4.2.3再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。 4.2.4选择稀释度10-2、10-3、10-4，加热100℃ 15min处理稀释液以杀死无芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。 在土壤稀释过程中，用不同的移液枪头由浓到稀来稀释。 4.3土壤中细菌的分离、纯化以及产淀粉酶的芽孢杆菌纯种的获取 4.3.1涂布平板培养：用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的淀粉牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做2个平板。37℃下恒温培养24h。 4.3.2挑选菌落点种：观察已培养的细菌，将形态不同的菌落在皿底用记号笔编号。在做好的淀粉牛肉膏培养基平板皿底用记号笔平均分成4个区域（视得到的单菌落数而定），注意做好标记，从上述平板中做好标记的菌落中挑取形态不同的点接种于对应的区域