(动物病毒学)第七章病毒的检测.ppt

* * * * * 红细胞凝集程度 （五）琼脂扩散试验（免疫沉淀反应、凝集沉淀反应） 可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇，特异性地结合形成肉眼可见的线状沉淀物。 琼脂双相扩散的沉淀线判定 Ag: 抗原 S1、S2、S3、S4：被检血清 + 阳性血清对照 - 阴性血清对照 （六）补体结合试验 补体：指存在于人和动物新鲜血清中，具有类似酶的活性的一组蛋白质，当存在Ag-Ab复合物或其它激活因子时，可以被激活而表现杀菌及溶菌等，起到补助和加强吞噬细胞和抗体等防御能力的作用，故名补体。 原理： 检验系统：已知Ag(Ab)+ 被检Ab（Ag）+补体 指示系统：绵羊红细胞，溶血素 病毒抗原 + 抗 体 羊红细胞 溶血素 +补体+ 溶 血（阴性） 病毒抗原 + 抗体（缺） +补体+ 羊红细胞 溶血素 不溶血（阳性） 病毒抗原（缺） + 抗 体 +补体+ 羊红细胞 溶血素 溶 血（阴性） 第二节 病毒检测的分子生物学方法 聚合酶链反应（PCR） 核酸杂交 分子生物学检测方法的特异性取决于核酸序列的特异性。 一、聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 1. 历史 由Kary Mullis 1985年根据自然扩增理论建立 1987完成自动化操作 Kary Mullis 于1993年获得诺贝尔化学奖 2. PCR原理（体外酶促基因扩增） 靶DNA双链分子加热变性后解链形成两条单链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs)存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5’ 3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA量增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板，经过30-50个循环，可使原DNA量增加106-109倍。 引物：与欲扩增的目的DNA的两条单链的3’端分别互补的两条寡核苷酸链。长度以15-30nt为宜。 PCR开始的几个循环 每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA量增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板，经过30~50个循环，可使原DNA量增加106~109倍。 PCR的主要步骤： 变性 通过加热（90-95℃）使DNA模板双链的氢键断裂，双链解离成单链DNA。 退火 适当降温（42-62℃）使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。 延伸 72℃，在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸底物（dNTPs)及Mg2+存在的条件下，引物延长，新链合成 循环次数 扩增的DNA拷贝 1 2 2 4 5 32 15 32，768 20 1，048，576 25 33，554，432 30 1，073，741，42 实际操作中，扩增效率往往低于理论值，原因是： 1）DNA引物经多次循环被消耗。 2）经多次高温处理后，Taq DNA聚合酶的活性下降。 3.常用PCR技术 由两对引物经两组循环完成。第一对引物（外引物）扩增出一条较长的产物；第二对引物以此为模板经二次循环扩增目的产物。较常规PCR更敏感。 普通PCR 巢式PCR（nested PCR) 伪狂犬病PCR诊断 1-4：病料为模板 M：Marker 使用一对外引物和一条内引物，在同一试管内完成反应。设计的内外引物Tm值相差较大，在开始20个循环时，使用较高的复性温度，此时仅外引物与模板结合，而在后20个循环中，用较低的退火温度，内引物可以与模板结合。 其敏感性与巢式PCR相似，但一次完成操作。 半巢式PCR（heminested PCR) 反转录PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR) 在常规PCR前增加了一步从RNA到cDNA的逆转录过程。 ORF5 基因cDNA的RT-PCR扩增 1：the result of RT-PCR 2：control(H2O) 多重PCR 用于多型别病毒的分型检测或同时检测几种病毒 试验中同时使用数对不同引物，为了检测方便，不同病毒或型别的目的产物长短要有一定差别 伪狂犬病毒-细小病毒二联PCR检测方法（双重PCR） 原位PCR 指将固定于载玻片的组织或细胞经蛋白酶K消化后，在不破坏细胞形态的情况下，直接进行PCR，可用于病毒在细胞和组织内的定位检测，PCR产物经标记探针杂交来检测。 定量PCR 广义的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。 狭义的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照