PCR及质粒提取.pptVIP

PCR技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是分子克隆技术中的常用技术之一。 PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。 实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程。 实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。 成 分 体积（μl） 10×Buffer（Mg2+ free） 2.5 MgCl2+（25 mmol/L） 1.5 dNTPs（各2.5 mmol/L） 2 引物1 1 引物2 1 Template 1 Taq DNA聚合酶（1 U/μL） 1 dddH2O 15 PCR扩增反应体系： 1. PCR扩增反应体系 2. PCR扩增程序设置 预变性 94℃ 5? 变 性 94℃ 30?? 退 火 60℃ 30?? 延 伸 72℃ 40? 补充延伸 72℃ 10? 8℃??????????????? 保存 30个循环 碱裂解法提取质粒DNA 质粒 (plasmid) 是存在于细菌染色体外的环状双链DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。 作用： 携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。 基因克隆操作步骤（五字经） 分——载体和目的基因的分离 切——限制性内切酶的应用 接——载体和目的基因拼接成重组体 转——重组体的转化 筛——DNA重组体筛选与鉴定 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。 本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的提取过程。 实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验原理：在碱性环境中，细菌染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。 1. 将1.5 ml过夜培养菌液放于EP管中，10 000 r/min离心1分钟，弃去上清液。 2. 加100 μl 溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5分钟。 3. 加200 μl 溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀4~6次，室温放置5分钟。 4. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰上放置10分钟。 操作过程 溶液I： 50 mmol/L葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA， pH 8.0 溶液II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液III：29.4g乙酸钾，11.5ml冰乙酸， H2O至100ml。 5. 12 000 r/m离心15 分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液转移至EP管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次（12 000r/min离心10分钟）。 6. 吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12 000r/min离心10分钟，沉淀DNA。 7. 70%乙醇洗涤沉淀2次，自然挥干。 8. 所得DNA溶于30~50 μl TE中，-20℃保存备用。 操作过程 TE溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 1 mmol/L EDTA, pH 8.0 实验要求：2人一组， 思考实验过程中各种试剂的作用。 生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学 * * * 生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学 * * *