反复冻融法-中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.8.8.105 菌体/细胞裂解法汇总 一、反复冻融法： 1、将细胞在20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余 细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2 、至少3 次以上冻溶。 3、IFCC 推荐法： 收集细胞悬液，4 ℃低温离心（3000rpm，5min ），弃上清，加入一定量PBS （200ul ）， 轻轻吹打混匀，200C 冷冻30min，370C 解冻，如此反复3 次，可形成细胞裂 解液。 4 、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37 度水浴，溶解后震荡， 再冻 二、超声波处理法 1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5 秒，间隙时间最好大 于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间 5 秒、间隙时间 10 秒、工作次数20 次。 2 、每个样本超声时间5 秒,每个间隔5 秒,粉碎5 次。 3、100ml 菌液离心，用8ml 缓冲液悬浮，加8mg 溶菌酶，冰浴30min，然后超 声处理。750W40 ％功率。5 秒超声，9 秒间隔。超声至少90min 。 4 、综合冻融和超声的方法： 1500g 离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS 重悬细胞。 将重悬液集中，1500g 离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约 5 倍体积的 PBS 缓冲液重悬细胞，并搅拌。 中国试剂网 3.8.8.105 可选择：4 ℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M 的KCl ，15mM 的DTT 。4 ℃下111500g×60min 离心裂解液。取出上清。过柱子。 PurificationofGSTFusionProteinsfromE.coliAlternateProtocol 三、渗透法： 冰冷的20mmol/LTrisCl （pH8.0 ），2.5mmol/LEDTA 处理，冰浴放置10min。 《精编分子生物学实验指南》 四、裂解液处理法： 1、细胞裂解液：50mmol/LTrisClpH6.8，100mmol/LDTT，2%SDS ，0.1%溴 酚蓝，10%甘油。SDS 是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。 2 、在loadingbuffer 加SDS，100 度5 分钟，是变性方法。SDS 与蛋白等量结合， 可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。 3、如果是做小量菌液，跑PAGE 胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer 煮沸5 分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm 至少5 分钟，然后 上样时，枪头别吸最底下的。 4 、20 毫升细胞裂解液配方:40L0.5MEDTA(PH8.0)，4ml10%SDS ，1ml1M Triscl(PH6.8)，14.96ml 蒸馏水。 5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声 呢？直接水煮不就可以了吗？ 6、将1ml 菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul2×上样缓冲液，煮10min，取 20ul 上样，就可以了。 7、检测蛋白诱导： 中国试剂网 3.8.8.105 从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min 离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS 上样缓冲液 （50mMTrisCl （pH6.8 ），100mMDTT，2 ％SDS，0.1 ％溴酚蓝，10 ％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min 离心。上样15ul，6 ％SDSPAGE 电泳。 《分子克隆》P826 8、510 秒离心，弃除上清，用50ul 蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入 50ul 热的2×SDS 上样缓冲液 （100℃加热）。迅速混匀后 100℃加热35min 。将 样品冰上放置 （或20℃放置），然后再溶解，煮沸 1min。离心30 秒。上样 5ul 进行SDSPAGE