基于蛋白质组学的细胞色素p450和葡萄糖醛酸转移酶亚型-分析化学.pdfVIP

第42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE )摇 研究报告 第1 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年1 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 10 ~15 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥藡蕥蕥 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2014.30741 研 究报 告 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥 藡 基于蛋白质组学的细胞色素P450 和 葡萄糖醛酸转移酶亚型绝对定量分析 1 2 1 *1 2 1 2 刘喜东摇 朱 俊摇 丛宇婷摇 胡良海 摇 叶明亮摇 顾景凯摇 邹汉法 1(吉林大学生命科学学院,长春 130012) 2(中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,大连 116023) 摘摇 要摇 利用蛋白质组学方法,将大鼠肝微粒体样品进行胰蛋白酶水解;再利用液相色谱鄄串联质谱法(LC鄄 MS/ MS),采用多反应监测模式(MRM),通过测定蛋白质水解后产生的特征酶切肽段,实现同时对大鼠肝微粒 体内药物代谢酶P450 和UGT 的绝对定量。 本实验首先建立标准工作曲线,对肝微粒体样品中P450 和UGT 进行定量,在线性范围内,相关系数r0.995,线性关系良好,定量限臆10 nmol/ L;以合成的稳定同位素标记特 征肽段作为内标,对UGT1A1进行定量分析。 结果表明,同位素标记特征肽段与未标记肽段色谱行为与质谱 响应一致,在基质溶液中同位素标记肽段线性关系良好,利用标准曲线法和稳定同位素稀释法测得UGT1A1 含量分别为17.30 和18.23 nmol/ g,两种方法所得结果基本一致,但稳定同位素稀释法操作简便,更适用于复 杂样品的高通量测定。 关键词摇 葡萄糖醛酸转移酶;多反应监测;肝微粒体;细胞色素P450;气相色谱鄄串联质谱 1摇 引摇 言 药物进入体内,可以通过代谢以一种或多种有活性的或无活性的代谢产物形式进行清除。 当药物 [1,2] 主要以代谢方式清除时,代谢途径对药物的安全性和疗效有很大的影响 。 在参与药物代谢的各类 酶中,细胞色素P450酶(简称CYP或P450)和尿苷二磷酸鄄葡糖醛酸转移酶(UGT)介导绝大部分的代 谢反应。 因此,实现对P450 和UGT家族中多种酶的定量,对研究药物代谢具有重要意义,从而为药物 研发、药物鄄药物相互作用(DDI)及临床前药代动力学研究提供科学依据。 在过去的研究中,常通过逆 [3,4] [5] [6,7] 转录聚合酶链式反应法(RT鄄PCR) 、2鄄维电泳法(2D鄄PAGE) 、免疫印迹法(Western blotting) 及 [8,9] 探针底物法 对药物代谢酶进行评价。 由于 mRNA 的翻译过程受多种因素的影响,因此测得的 mRNA 的量不能准确代表蛋白酶的水平;又因为药物代谢酶具有高度的序列同源性,使得现有方法专 属性差,伴有一定的交叉反应,这些方法上的缺点都限制了对药物代谢酶的研究。 随着质谱技术的发展和在蛋白质组学研究中的应用,实现了对复杂体系中蛋白肽类物质的定性和 定量研究[10~14] ,也为药物代谢酶的定量提供了理论依据和实验基础。 本实验通过分析药物代谢酶的氨 基酸序列,找出能代表各蛋白酶的特征肽段,利用高效液相色谱鄄串联质谱技术以及标准曲线法,同时实 现对P450 和UGT 的直接定量分析;以合成的同位素标记肽段作为内标,对复杂基质中待测物进行定 量。 以往的间接定量实验操作繁琐,影响因素多,所得结果不能直观反应实际药物代谢酶水