基因克隆技术及其进展-中国医药生物技术.pdfVIP

448 中国医药生物技术 2015 年10 月第10 卷第5 期 Chin Med Biotechnol, October 2015, Vol. 10, No. 5 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.05.013 ·综述· 基因克隆技术及其进展 兰泓，张玉祥 基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因 简便性，又有 TA 克隆的克隆效率，特别适合 Pfu DNA 聚 与具有自主复制能力的载体 DNA 进行体外重组，获得新 合酶扩增的 PCR 产物。这种平末端 PCR 产物可以在拓扑 的重组 DNA 后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋 异构酶 I 的作用下直接插入平末端载体中产生克隆[5] ，无 白结构与功能及其与其他分子的相互作用。最近，随着非编 需对平末端 PCR 产物另外进行加 A 尾处理。Invitrogen 码 RNA 的发现，这项技术也用于 RNA 的研究。基因克 公司的 TOPO-TA 就是一例。 隆技术从发明到现在经历了三个发展阶段。第一个阶段是 异质交错克隆技术是另一种只需连接酶的克隆方法。这 20 世纪 70 年代初经典的基因克隆技术的创建[1-2] 。经典的 种方法需要两对 PCR 引物，对同一目的片段进行两次 基因克隆技术是需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法，至 PCR 扩增，第一次 PCR 的上游引物 5 端引入 GGG ，第 今仍被广泛应用。第二个阶段是 20 世纪 90 年代初不依赖 二次 PCR 的下游引物 5 端引入 GGG ，两次 PCR 产物变 连接酶的克隆方法的出现[3] 。这种方法不需要连接酶的参 性、退火后获得 4 个 DNA 片段，将此 4 个 DNA 片段 与，不受限制性内切酶的限制，使得基因克隆更加灵活。第 与 3 末端 GGG 突出的载体连接，以获得目的片段的重组 三个阶段是 21 世纪初将重组酶运用到基因克隆中[4]，使基 质粒。Liu[6]通过实验比较 TA 克隆与异质交错克隆两种方 因克隆更加强大，靶向性更强，操作更简便。本综述从基因 法，发现后者的克隆效率更高。 克隆技术发展的这三个阶段入手，概述各项方法的原理和特 点，方便人们根据自己的需求选择合适的基因克隆方法。 2 依赖修饰酶的克隆方法 这类克隆方法不受限制性内切酶酶切位点的限制，而是 1 依赖连接酶的克隆方法 用一些 DNA 修饰酶使目的基因和载体分别形成较长（十 1.1 需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法——平末端克 几个至几十个碱基）的互补的 3 或 5 突出末端，通过互 隆和粘性末端克隆 补的突出末端间的退火互补复性而达到 DNA 重组。相对 这是最为传统、最为经典的基因克隆方法，也是目前仍 于第一阶段的克隆方法而言，这些方法从一个新视角进行体 然被广泛使用的克隆方法，特别是粘性末端克隆法。它是利 外重组 DNA ，克服了低连接效率和受限制性内切酶酶切位 用限制性内切酶能识别并酶切特异 DNA 序列的特性，使 点限制的问题，使得基因克隆更加灵活，更具有可操控性， [7-9] 目的 DNA 片段和载体产生平末端或粘性末端，然后在 因而被许多研究者用于质粒构建中 。 DNA 连接酶的作用下，将酶切后的目的