不同启动子驱动下转基因盐藻外源基因的稳定表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（３）：４７～５３ 不同启动子驱动下转基因盐藻 外源基因的稳定表达 李　杰　曲东京　刘玲玲　冯书营　薛乐勋 （郑州大学细胞生物学研究室　郑州大学第一附属医院　郑州　４５００５２） 摘要　为了探讨外源性与内源性启动子对转基因盐藻外源基因表达的影响，利用编码草丁膦乙 酰转移酶的ｂａｒ基因作为筛选标记，将含外源性启动子 ＣＭＶ３５Ｓ的表达载体 ＣＭＶ３５Ｓｂａｒ（Ｇ１２） ? 和含内源双拷贝碳酸酐酶启动子ＤＣＡ１的表达载体ＤＣＡ１ｂａｒ（ＤＢ）分别转化盐藻，筛选稳定转化 ? ? 株后，观察在不同启动子驱动下外源基因的表达情况及对转基因盐藻生长的影响。通过电击法分 别将表达载体Ｇ１２和ＤＢ转化盐藻，经草丁膦（ＰＰＴ）筛选后，各得到了３株 ＰＰＴ抗性藻株，经 ? ＰＣＲ及测序分析证实外源基因ｂａｒ已经整合到盐藻的基因组中，半定量 ＲＴＰＣＲ结果显示，在内 ? 源性启动子ＤＣＡ１驱动下，ｂａｒ基因的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下ｂａｒ的表达，并且 ＤＢ转化株的ｂａｒ基因表达在盐诱导下其表达明显提高，而Ｇ１２转化株中ｂａｒ基因的表达对盐诱 ? 导无反应。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析显示，外源基因的拷贝数与不同启动子间无相关性。转化株的生长 特性分析显示，ＤＢ转化株的生长速度明显高于Ｇ１２转化株。结果表明，内源诱导型启动子在驱 ? 动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源组成型启动子更具有优势。 关键词　启动子　稳定表达　转基因盐藻 中图分类号　Ｑ７５４ ［２］ 　　启动子的选择是决定外源基因在转基因宿主中能 经初步鉴定了一些外源组成型启动子，耿德贵等 利用 否表达和控制表达量的关键因素，因此关于启动子的 ＧＵＳ基因的瞬时表达比较了几种外源型启动子 研究是转基因研究，表达调控机制研究等领域的核心 （ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉｌ、Ｕｂｉｌ 、ＣａＭＶ３５ＳＵｂｉｌ和 ＣａＭＶ３５Ｓ ?Ω ? ? 内容。目前，已有大量的启动子被克隆，根据其来源不 ［３］ Ｕｂｉｌ ）的表达效率，李杰等 研究了ｅｇｆｐ在盐藻细胞 ?Ω 同，分为来源于宿主之外的外源性启动子和来源于宿 中的瞬时表达，验证了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子在盐藻中的活 主自身的内源性启动子；根据其转录模式不同分为组 ［４］ 性，进而Ｔａｎ等 通过基因枪的方法将含ＣａＭＶ３５Ｓ启动 成型启动子和诱导型启动子。 子的载体转化盐藻，获得了稳定的转化株。因外源性启 　　杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ，以下简称盐藻）是一种 动子的表达效率低下，且多呈瞬时表达，因此本课题组近 原生质体裸露的嗜盐性浮游单细胞真核生物，可在高达 几年来侧重于盐藻内源性启动子（如双拷贝碳酸酐酶启 ５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠溶液中生长繁殖，