氧化应激下视网膜色素上皮细胞外泌体对视网膜色素-中华眼底病杂志.pdfVIP

中华眼底病杂志 2017 年 1 月第 33 卷第 1 期 Chin J Ocul Fundus Dis, January 2017, Vol. 33, No. 1   • 57 •     • 论著 • 氧化应激下视网膜色素上皮细胞外泌体对 视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A 及丝氨酸/苏氨酸激酶表达的影响 张惟   杨婧   陈松   何广辉   马映雪   陈莉   姜鉴洪   宋建 300020  天津市眼科医院 天津市眼科学与视觉科学重点实验室 天津市眼科研究所 天津医科大学眼科临床学院 通信作者: 陈松, Email: chensong20@ DOI: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.01.015 【摘要】 目的    观察氧化应激下视网膜色素上皮细胞（RPE）外泌体对RPE细胞血管内皮生长因子 （VEGF）-A 及丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）表达的影响。方法    培养人RPE （ARPE-19）细胞，细胞培养基中 加入浓度为2.5 μmol/L鱼藤酮诱导ARPE-19细胞发生氧化应激损伤。收集上清液，采取梯度超速离心法分离纯 化外泌体。应用透射电子显微镜观察外泌体形态；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 ARPE-19 细胞外泌体 表面特异性标志蛋白CD63的表达。将氧化应激下ARPE-19细胞外泌体与ARPE-19细胞共培养作为实验组，等 量正常RPE细胞外泌体与ARPE-19细胞共培养作为对照组。采用噻唑蓝比色法检测ARPE-19细胞的细胞活力， 以酶联免疫检测仪测量波长570 nm处各孔的吸光度[A ，旧称光密度（OD ）]值表示；免疫荧光染色法和 Western blot检测ARPE-19细胞VEGF-A、Akt 蛋白表达；实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测ARPE-19细胞 VEGF-A、Akt mRNA表达。结果    透射电子显微镜观察发现，ARPE-19细胞外泌体呈圆形或椭圆形膜性小囊 泡，直径50～150 nm。Western blot检测结果显示，ARPE-19细胞外泌体表面表达特异性标志蛋白CD63。噻唑 蓝比色法结果显示，实验组、对照组ARPE-19细胞在波长570 nm处的 A  值分别为0.582±0.015、 0.787±0.032。实验组ARPE-19细胞在波长570 nm处的 A  值较对照组明显降低，差异有统计学意义 （t=20.886，P ＜0.05）。免疫荧光染色法检测结果显示，与对照组比较，实验组ARPE-19细胞VEGF-A蛋白表 达明显增强，Akt蛋白表达明显减弱。Western blot 检测结果显示，与对照组比较，实验组ARPE-19细胞VEGF- A蛋白相对表达量明显升高，Akt蛋白相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（t=3.822、6.527， P ＜0.05）。RT-PCR 检测结果显示，与对照组比较，实验组ARPE-19细胞VEGF-A mRNA相对表达量明显升 高，Akt mRNA 相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（t=8.805、−7.823，P ＜0.05）。结论    氧化应激 下ARPE-19细胞外泌体可抑制正常AREP-19细胞增生，上调VEGF-A表达，下调 Akt 表达。 【关键词】 血管内皮生长因子 A；  蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶；  外泌体；  视网膜色素上皮；  细胞, 培 养的；  氧化性应激         基金项目： 天津市应用基础与前沿技术研究计划项目(14JCYBJC27400)；天津市卫生局科技基金 （2015KY37） 中图分类号：R774.1   Influence of oxidative stress-induced exosomes on Akt and vascular endothelial growth factor-A of retinal pigment epithelium cells Zhang Wei, Yang Jing, Chen Song, He Guanghui, Ma Yingxue, Chen Li, Jiang Jianhong, Song Jian Tianjin Eye Hospital, Tianjin Key Lab of Ophthalmology and Visu