人camkkβ蛋白的原核表达纯化及活性测定-中国医药生物技术.pdfVIP

208 中国医药生物技术 2014 年 6 月第 9 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2014, Vol. 9, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.009 ·论著· 人 CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化 及活性测定 刘亚晋，谭初兵，时丽丽，潘晓菲，徐为人 【摘要】 CaMKK β 在体内广泛分布，尤其在神经系 目的 对原核体系表达的 CaMKKβ 蛋白体外活性进行探 统[9-10] 、睾丸、脾脏、肝脏、肺等组织器官内，可 索，为针对 CaMKKβ、AMPK 药物研发提供科研基础。 参与多种生理活性的调控，如神经系统、肿瘤、能 方法 克隆人 CaMKKβ 基因，建立原核表达载体 量代谢[11]、外围髓系粒细胞发育调控[12]等，是功能 pET28a-CaMKKβ，将其转化入 E.coli Rosetta(DE3) 感受态 最广泛的 CaMKs 之一。CaMKKs 的信号级联反 细胞内，在 16 ℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达 应对神经元进程中的磷酸化起重要作用，这些进程 CaMKKβ 蛋白，Ni-NTA 纯化 6His-CaMKKβ 蛋白，并利 包括学习和记忆形成[13-14] 、神经分化和迁移[9-10] 、 用 Glo™ Max Assay 方法检测其活性。 轴突生长和突触发生[15-16]等。在中枢神经系统内， 结果 通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ 质粒构建成 CaMKKβ 广泛分布于海马区、嗅球、齿状回、杏 仁核、下丘脑、小脑[17] ，因此，CaMKKβ 在海马 功；重组人 CaMKKβ 蛋白可溶性表达量较高，Ni-NTA 纯 记忆、小脑发育、下丘脑激素分泌及能量摄入-消耗 化 6His-CaMKKβ 蛋白纯度可达 80% 以上，活性检测结果 2+ 调控中发挥着重要的作用。研究证明，在下丘脑神 表明，大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ 蛋白在 CaM/Ca 存在与否情况下，酶活基本一致。 经元内 CaMKKβ 与 AMPK 、Ca2+/CaM 形成复合 物，发挥着调控能量动态平衡的重要作用；基因敲 结论 成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ，实现重组 除 CaMKK β 后，AMPK 活性降低，同时 NPY 人 CaMKKβ 在原核体系内可溶性表达，活性测定表明原核 2+ （neuropeptide Y ）和 AgRP （agouti-related protein ） 体系内表达的 CaMKKβ 自主酶活性较强，受 CaM/Ca 影 基因表达下调，虽然可避免小鼠形成由饮食诱导的 响较小。 肥胖、高血糖和胰岛素抵抗等[18-19]，但同正常喂养 【关键词】 钙-钙调素依赖性蛋白激酶； 腺苷酸活化蛋 的野生小鼠相比，CaMKKβ 基因缺失的小鼠含有 白激酶； 色谱法，亲和； CaM/Ca2+ 较多脂肪组织，且生长缓慢。此外，在肝脏、肌 中国医药生物技术, 2014, 9(3):208-213