人ox40胞外区基因的克隆原核表达及单克隆-中国医药生物技术.pdfVIP

278 中国医药生物技术 2014 年 8 月第9 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2014, Vol. 9, No. 4 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.006 ·抗体药物研究新趋势· 人 OX40 胞外区基因的克隆、原核表达 及单克隆抗体的制备 吕卫东，李俊鑫，刘绿艳，李欣，崔璐璐，万晓春 【摘要】 1 材料与方法 目的 制备抗人 OX40 单克隆抗体，为进一步研究 1.1 主要材料 OX40/OX40L 通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治 pET32a(+) 、pLVX-IRES-ZsGreen 、BL21(DE3) 、 疗和药物筛选奠定基础。 HEK293T 细胞由本实验室保存；人 OX40 基因全 方法 PCR 扩增人 OX40 胞外区的基因序列，将其构建到 长 ORF 克隆购自北京义翘神舟生物技术有限公 原核表达载体 pET-32a(+) 中，利用大肠杆菌表达系统表达 司；DMEM 培养基、胎牛血清、HAT 及 PEG4000 OX40 胞外区蛋白，经 Ni 柱纯化后获得目的蛋白。以纯化 购自美国 Sigma 公司；限制性核酸内切酶、Taq 的 OX40 胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠，采用常规方法进 DNA 聚合酶、DNA 分子量标记均购自日本 Takara 行细胞融合，通过 ELISA 和多次克隆化培养，筛选出分泌 公司；T4 DNA 连接酶为美国 Thermo 公司产品； 特异性鼠抗人 OX40 单克隆抗体的杂交瘤细胞株；通过 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于北京康润诚 ELISA 、Western blot 和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。 业生物科技有限公司。6 ~ 8 周龄 SPF 级 BALB/c 雌性小鼠，购自广东省医学实验动物中心，合格证 结果 成功构建人 OX40 原核表达质粒 pET-32a(+)-OX40 ， 号：SCXK （粤）2008-0002 。 并在 BL21(DE3) 中诱导表达，经 SDS和 Western blot 鉴定、Ni 柱纯化、透析后获得 OX40 胞外区蛋白；以 1.2 方法 此纯化蛋白为免疫原，成功制备具有较强亲和力的单克隆抗 1.2.1 pET32a(+)-OX40 重组质粒的构建及鉴 体。 定 以人全长 OX40 cDNA 为模板，上游引物 F ： CATGCCATGGAACTCCACTGTGTCGGGGACAC 结论 克隆表达并纯化了人 OX40 蛋白，成功制备针对该 C，下游引物 R ：CCCAAGCTTTTAGATGGCGGCA 蛋白的高亲和力单克隆抗体，为进一步研究 OX40/OX40L ACCGCACG （下划线分别为Noc I 和 Hind III 酶 的生物学功能奠定了实验基础。 切位点），扩增 OX40 基因。PCR 扩增程序：94 ℃ 【关键词】 受体，OX40 ； 基因表达； 抗体，单克隆 预变性 5 min ；94 ℃ 变性 50 s ，52 ℃ 复性 35 s ， 中国医药生物技术, 2014, 9(4):278-282