人线粒体trnaleuuur及其突变体的基因克隆表达和纯化-oalib.pdfVIP

( C 辑) 第30 卷 第6 期 SCIENCE IN CHINA ( Series C ) 2000 年 12 月 人线粒体tRNALeu(UUR)及其突变体的 基因克隆 表达和纯化* 韩伟国 陈 莉 刘 静 查锡良 金由辛 ** 王德宝 ( 中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室, 上海 200031 ; 上海医科大学生物 化学教研室, 上海 200032) 摘要 将化学法合成的人线粒体 tRNALeu(UUR) 及其突变体(tRNALeu(M))基因分别连接到 载体pGEM-9zf () 中, 并转化到大肠杆菌 JM109 中得到两个转化体分别为Leu-W 和 Leu-M. 在 IPTG 的诱导下, tRNALeu(UUR) 和 tRNALeu(M) 的表达量可达总小分子 RNA 的 19.10%和17.76%. 经DEAE-sepherose CL4B 柱层析可使它们的纯度提高3 倍. 最后用 15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化, 并用大肠杆菌亮氨酰 tRNA 合成酶(LeuRS)分别 测定了它们的氨酰化反应动力学常数. 结果显示, mtRNALeu(M) 的 Kcat / Km 值约为 mtRNALeu(UUR) 的1/5, 提示该突变可使mtRNALeu(UUR) 的氨基酸接受能力明显下降. 关键词 人线粒体tRNALeu(UUR) 突变体 基因克隆 表达 纯化 线粒体是细胞内重要的细胞器, 许多生化反应都发生在线粒体内, 特别是通过氧化磷酸 化作用产生 ATP 供生命活动需要. 线粒体 DNA 编码的 tRNA 总数只有22 个, 与相应氨基酸 种类之比基本是 1 1. 在线粒体中, 目前尚未发现来自胞浆的线粒体tRNA[1], 因此若某一种 线粒体tRNA 因基因突变而使其生物活性发生改变, 必然会影响线粒体的蛋白质合成功能. 而 线粒体内主要合成呼吸链中氧化磷酸化的 13 个酶, 这些酶的数量和活性变化直接影响线粒体 氧化磷酸化功能, 导致组织细胞能量代谢的障碍. [2] 近年研究表明, 许多线粒体病与线粒体的tRNA 基因突变有关 . 1990 年日本学者首先在 线粒体肌脑病伴乳酸性酸中毒及中风样发作综合征(mitochondrial encephalomyophthy, lactic acidosis and stroke-like episodes syndrome, MELAS)病人中发现异质性线粒体tRNALeu(UUR) 基因 [3] [4] np3243A G 点突变 . 随后相继发现该突变也与 型糖尿病 神经性耳聋及心肌病有关 . 迄 今, 线粒体 tRNALeu(UUR)基因 np3243A G 点突变的致病机理尚不清楚. 然而, 原位杂交结果 Leu(UUR) [5] 表明: 在MELAS 病人中, 线粒体内tRNA 的表达量并没有下降 ,