平欧杂种榛实时荧光定量pcr内参基因的筛选与体系-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2017,50(12):2399-2410 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.12.020 平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与体系建立 1 2 2 2 1 杨丹 ，李清 ，王贵禧 ，马庆华 ，朱利泉 1 2 （西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716 ； 中国林业科学研究院林业研究所/ 国家林业局林木培育实验室/林木遗传育种国家重点实验室， 北京 100091 ） 摘要：【目的】构建中国榛属植物主要栽培种平欧杂种榛实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选体系，并筛选稳 定的内参基因，为榛属植物的基因表达分析提供内参基因，进而为其植物资源利用和创新育种研究提供理论基础。 【方法】利用课题组前期对平欧杂种榛不同亲和性授粉、授粉后不同时间的雌蕊转录组测序数据，结合相关文献 搜索，共选取12个候选内参基因；以平欧杂种榛主栽品种‘达维’的盛花期雌蕊、未伸长期雄花序、幼嫩叶片、 花粉、一年生枝形成层、嫩茎、根尖、根蘖等 8 个不同组织器官为研究材料；通过反转录 PCR 初筛，实时荧光定 量PCR检测表达量，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct程序和RefFinder在线网站评价内参基 因的稳定性。【结果】反转录PCR初筛表明，12个候选内参基因引物的特异性良好， ChaSTP5 和 ChaTF 在不同组织 器官材料中表达存在明显差异，其余候选内参基因在8个组织中均有表达。实时荧光定量PCR的表达谱分析表明， Ch18S rRNA 的表达量最高，ChaSTP5 表达量最低，其余10 个候选内参基因均为中等表达量；ChaSTP5 和 ChaTF 的 稳定性最差，其余10个候选内参基因的稳定性处于中等水平。geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct的 结果表明，ChaActin 均排名第一，为最稳定的内参基因，Ch18S rRNA 的排名均在前五，而其他候选内参基因在不 同程序分析结果中的排名存在差异。稳定性综合分析表明，ChaActin 和 Ch18S rRNA 的稳定性良好，即在 8 个不 同组织器官中表达量均一且在4个稳定性分析程序中均排名靠前，适合作为内参基因；geNorm程序的变异系数分 析则表明，选取6个内参基因便可对RT-qPCR的数据进行精准的标准化处理；相关性分析表明，4个程序均在0.01 水平上呈现显著的相关性，NormFinder和Delta Ct程序的相关性最高，Delta Ct与BestKeeper的相关性最低。 【结论】建立了平欧杂种榛实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选体系：以反转录 PCR 初筛引物，荧光定量 PCR 分析 引物特性及基因表达，4个程序单独评价引物稳定性，RefFinder综合分析选出最适稳定内参基因，并选出榛属植 物8个不同组织器官中最为稳定的2个内参基因 ChaActin 和 Ch18S rRNA。 关键词：平欧杂种榛；实时荧光定量PCR；内参基因；稳定性；体系建立 Reference Genes Selection and System Establishment for Real-Time qPCR Analysis in Ping’ou Hybrid Hazelnut (C. heterophylla Fisch. × C. avellana L.) 1 2