第章 固相膜免疫分析技术课件.pptVIP

重点提示 原理 技术要点 方法学评价 原 理 Dot-ELISA的实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA所用载体为NC膜。其原理为样品中的抗体或抗原与预先包被在NC膜上的抗原或抗体发生抗原抗体反应，然后再加入相应的酶标二抗进行反应，反应结束后，通过酶催化底物，形成有色的沉淀物，产生显色反应，根据染色条带或斑点的有无或深浅，对抗体或抗原进行检测。阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色条带或斑点。 图11-4 Dot-ELISA示意图 技术要点 抗原包被：优化抗原的浓度。 抗原抗体反应：滴加样品血清，待检抗体与NC膜上抗原结合。 确定酶结合物最佳稀释度：一般以阴性样品不显色而阳性样品显色最强的酶结合物稀释度为最佳稀释度。 显色反应：在盐酸联苯胺和过氧化氢为底物时，溶液pH值应在5.8～6.0，此时反应最灵敏。 方法学评价 优点： 1.吸附蛋白能力强 2.可同时检测多种抗体 3.其它：实验和结果判断不需特殊设备条件，结果可长期保存 第五节 免疫印迹试验 重点提示 原理 技术要点 方法学评价 原 理 技术要点 抗原印迹与包被 抗原抗体反应 检测 抗原等蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上 放射自显影法 底物化学发光法 底物荧光法和底物显色法 方法学评价 特异性强， 用于病原体 确认 1 3 同时检测多种抗体 4 膜条可重复检测应用 吸附蛋白 能力强 2 2 第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素 重点提示 试剂方面 标本方面 实验过程 影响因素：试剂 试剂的选择：注意试剂的注册号、批号、有效期和检验合格证等；不同批号的试剂不能混用；不能使用过期的试剂。 试剂的准备：试剂在开封前应检查是否漏液、漏气；使用前要在室温（18℃～25℃）下平衡20min～30min。 影响因素：标本 标本处理：临床检测的标本有痰液、尿液、粪便、棉拭子、血清和血浆等。检测前，需进行相应的前处理，如痰液或粪便，需用缓冲液或生理盐水稀释后，低速离心，取上清进行检测。 标本保存：对于采集的标本如不能立即检测，需要保存在2℃～8℃，不超过24小时，超过24小时以上，需保存在-20℃以下，忌反复冻融。 影响因素：实验过程 温度及时间 结果判定 检测前要平衡至 室温（18～25℃） 后再开袋使用。 无特殊说明，检测的温度为18～25℃，时间在3Omin以内。 一些胶体金诊断试剂条只用于初步诊断， 确诊需采用免疫印迹实验进行。 试剂条平衡 第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用 临床应用 类别 检验项目 检测方法 心肌标志物 乳酸脱氢酶(LD)同工酶谱肌酸激酶(CK-MB)及其同工酶 免疫印迹试验、荧光免疫层析试验 N-端脑利钠肽前体、心肌肌钙蛋白I、心钠肽(ANP)和脑钠肽(BNP)等 酶联免疫斑点法 感染性疾病 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) 胶体金免疫层析试验 丙型肝炎抗体(抗-HCV抗体) RIBA 人类免疫缺陷病毒抗体（HIV）1/2型抗体 胶体金免疫层析试验、免疫印迹试验 自身免疫疾病 抗Sm抗体、抗U1RNP抗体、抗Rib抗体、抗ssA抗体、抗ssB抗体、抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体、抗Ro60抗体等。 RIBA、酶联免疫斑点法、胶体金免疫层析试验 抗丙酮酸脱氢酶复合物（AMA-M2）、肝肾微粒体（LKM-1）、细胞色素P450、细胞浆肝抗原(LC-1)、可溶性肝抗原-肝胰抗原（SLA/LP）抗体检测。 RIBA 抗丝氨酸蛋白酶3（PR3）、髓过氧化物酶（MPO）、肾小球基底膜（GBM）抗体。 斑点渗滤法 肿瘤标志物 抗前列腺特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)对、糖蛋白抗原（CA50、CA125、CA153、CA199）等 胶体金免疫层析试验 生殖相关 人绒毛膜促性腺激素(HCG) 胶体金免疫层析试验 性相关疾病 淋病、尖锐湿疣、生殖器疱疹病毒（HSV)-IgG、梅毒螺旋体抗体。 胶体金免疫层析试验、WB、乳胶免疫层析法 过敏原 血清总IgE、总IgG、特异性IgE 胶体金免疫层析试验 毒品 大麻、吗啡、甲基安非他明、氯胺酮(K粉)、美沙酮等 胶体金免疫层析试验 本章小结 固相膜免疫技术是在酶联免疫吸附试验、单克隆抗体技术、荧光免疫技术、胶体金免疫技术和固相膜的基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，常用的有胶体金层析实验、荧光免疫层析实验、斑点渗滤实验、斑点酶免疫吸附实验和Western-blot、重组免疫印迹试验等。具有检测速度快、灵敏度高，样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小，操作简单，不需贵重仪器，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，广泛应用于临床检测，是床边检验的主要方法。 Thank you