超高效液相色谱r串联质谱法分析骨髓间充质干细胞-中国药理学通报.PDFVIP

·１２９８· 中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０１７Ｓｅｐ；３３（９）：１２９８～１３０３ 网络出版时间：２０１７－８－２０１６：４７　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ１６４７．０４２．ｈｔｍｌ 超高效液相色谱 －串联质谱法分析骨髓间充质干细胞 衰老过程中的全基因组ＤＮＡ甲基化水平变化 １，２ ２ ２ ２ １ 何国东 ，杨翔宇 ，李晓红 ，潘　宇 ，余细勇 ［１．广州医科大学药学院，广东广州　５１１４３６；２．广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究部，广东广州　５１００８０］ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１７．０９．０２１ 同位素内标校准进行含量测定，另一种是利用酶解 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１７）０９－１２９８－０６ 的方式将ＤＮＡ酶解，同样通过酶解产物的标准物质 中国图书分类号：Ｒ３２９．２４；Ｒ３３９．３８；Ｒ３９４２；Ｒ４４６１ 配成的溶液与其同位素内标校准进行含量测 摘要：目的　使用超高效液相色谱－串联质谱测定骨髓间充 ［４－５］ 定 。不论是酸解还是酶解，由于是使用标准溶 质干细胞中全基因组ＤＮＡ甲基化水平，观察其衰老过程中 液进行校准定量，校准曲线样本无法模拟标本ＤＮＡ 甲基化率的变化。方法　从骨髓间充质干细胞中提取 ＤＮＡ，使用酶解法将ＤＮＡ分解成单个脱氧核苷，采用超高效 提取降解后的生物基质，而降解ＤＮＡ的过程步骤较 液相色谱法分离，正离子电喷雾与多反应监测模式进行定 为繁琐，需时６～１２ｈ，分析效率不高。本文在以前 量，分析５甲基脱氧胞嘧啶核苷、脱氧鸟嘌呤核苷的相对含 研究的基础上，改进 ＤＮＡ样本处理方法和定标方 量，计算全基因组ＤＮＡ甲基化率。结果　对１ ｇＤＮＡ样本 μ 式，并应用于分析骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ －４ 进行１ｈ酶解反应，２ｍｉｎ内可分析出５００×１０ 水平以上 ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＳＣｓ）衰老过程中全基 －２ 的ＤＮＡ甲基化率，日内及日间精密度分别在７１２×１０ 和 因组ＤＮＡ甲基化水平。该方法样本处理方式简单 ０１１９以内。随着骨髓间充质干细胞传代扩增培养，干细胞 快速，分析周期短，重现性好，具有良好的灵敏度和 不断衰老，其甲基化率逐渐降低，传至Ｐ４～Ｐ６代时，干细胞 精密度，可满足生物样品的全基因组ＤＮＡ甲基化水 甲基化率最低，随着传代的继续，其甲基化率逐渐上升。结 平分析。 论　此方法成功应用于检测研究骨髓间充质干细胞在衰老 过程中全基因组ＤＮＡ甲基化水平的变化，得到了衰老影响 １　材料与方法 骨髓间充质干细胞 ＤＮＡ甲基化的初步数据。经考察，该方 １．１　仪器与试剂　ＡＣＱＵＩＬＹＵＰＬＣ超高效液相色 法样本前处理方法简便，可操作性强，定量方式快速准确，具 谱仪（Ｗａｔｅｒｓ，美国）；ＸｅｖｏＴＱｓ三重四极质谱仪 有良好的灵敏度与重复性。 （Ｗａｔｅｒｓ，美国）；ＭＥＴＴＬＥＲＸＡ２０５ＤＵ十万分之一电 子分析天平（ＭＥＴＴＬＥＲ，德国）；ＡｌｌｅｇｒａＸ３０Ｒ台式 关键词：超高效液相色谱；质谱；骨髓间充质干细胞；衰老； 高速冷