重组牛γ干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11欢学术研讨会 重组牛v干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定 杨卫冲‘，焦新安，潘志明1，张苏华2孙泉云2，黄金林‘ (扬州大学生物科学与技术学院人兽共患病学与免疫学研究室，江苏’扬州，225009 上海市畜牧兽医站，上海，201103) 异性单抗。本研究为进一步研究rBovlFN—Y单抗在研究牛免疫细胞功能、牛的免疫调控、牛疫病的致病 机制及其诊断中的应用奠定了基础。 关键词： 牛Y干扰素；原核表达；真核表达：单克隆抗体 IFN吖具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、影响细胞分化等多种生物学功能，在免疫应答中的角色十分 高质量的纯化IFN-?作为免疫原。但是，一般情况下体内仅产生微量IFN吖，即使通过生物细胞诱导的途 径产生IFN-?，也因为成本高、纯化工艺复杂等诸多原因，而极大地限制了l临床和科研上的应_I=}j。因此， 怎样利用生物技术制备IFN-?及其单抗成为生物、医学研究领域的重要课题。随着基因重组技术的不断发 展和完善，通过原核表达系统表达某种蛋白抗原，利用亲合层析等技术对产物进行纯化，再利用纯化后的 抗原物质作为免疫原，免疫动物制备McAb成为可能。与此同时，DNA疫苗理论的提出和成功实践，为 制备那些具有重要生物学活性而又不易获取的物质的McAb提供了又一个重要的技术途径。 在成功克隆BovlFN-?基因并在大肠杆菌中成功表达rBovlFN-?的基础上，分别用原核表达产物 牛的免疫调控、牛病的致病机制及其诊断中的应用打下了基础。 1材料与方法 ． 1．1材料 1．1．1质粒、菌株，纯化rBovlFN-Y N-?、 rGST-BovlFN-y均由本室制各和保存。 1．I．2主要试剂 1025 牛羊传染稿 菌小牛血清为郑州佰安公司产品；其余常规试剂为国产分析纯试剂。 1．1．3实验动物和细胞系 保存。 1．2方法． 1．2．1 pVAXl—PreBovlFN．q质粒的大量提取 质粒的大量提取及纯化按文献口1方法进行。 1．2．2 pVAXl一PreBovlFN吖质粒的酶切婺定并进行DNA序列测定 Hind[II+BamH I双酶切，1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。验证无误后送联合基因科技有限公司进行DNA 序列测定。 1．2．3 pVAXl．PreBovIFN-,／质粒转染COS．7细胞试验 转染参照Invitrogen Lipofectin试剂说明书进行。 1．2．4纯化融合蛋白rHIS．BovlFNl、rGST-BovlFN-T的浓度测定 1．2．5免疫程序 1．2．5．1质粒免疫组91：分别在0、3、6周由双侧股四头肌注射100 Pg(约lOOpl)真核表达质粒 加强免疫。 1．2．5．2纯化融合蛋白免疫组【4，5l：首次免疫，腹部皮下多点注射lOOJ』_g经弗氏完全佐剂充分乳化的纯化 次免疫，间隔3周后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的BALB／c小鼠进行尾静脉加强免疫(100pg 不加佐剂的纯化rHIS—BovIFN-Y)。 1．2．6细胞融合 质粒免疫组加强免疫10天后，纯化融合蛋白免疫组加强免疫3天后，摘服球采血，分离血清作为阡I 性对照。取免疫鼠脾细胞按照文献【61方法与Sp2／0．Ag．14细胞进行融合。 1．2．7筛选方法的建立 筛试验，后者的目的是为了排除由于纯化蛋白中残存的微量的重组菌体的其它成分而导致的非特异性反 应。 1．2．8阳性克隆的筛选和克隆化 参照文献口】方法进行。以阳性：阴性2．1为阳性。选取只与纯化rGST-BovlFN吖反应而不与 BL21／pGEX·6P·l诱导后裂解液上清反应的细胞克隆判定为刚性克隆。经过有限稀释法多次克隆化后，扩 大培养，建株冻存。 l。2．94、鼠单抗腹水的制备 5x10，／只培养至