基因芯片检测奶牛乳房炎主要致病菌的方法研究.pdfVIP

牛羊传染病 基因芯片检测奶牛乳房炎主要致病菌的方法研究士 李秀萍1，尹逊河’，昊时友2，尹燕博j郑彤彤2韩丽敏2 (1．山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2．山东澳兰生物工程研究院，山东青岛266101) 摘要：为提高奶牛乳房炎主要致病茵的检测速度和准确性，建立一次实验就能检测奶牛乳房炎主要致病菌 的方法，从而为临床治疗提供依据，我们建立了用基囚芯片检测奶牛乳房炎主要致病越的方法。利用生物 信息学手段和查阅文献资料设计了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、乳 房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌的通用引物和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针 及无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的特异引物，并用这三种特异引物扩增的片段的纯化产物作为这 三种链球菌的检测探针。在引物对样品中的细菌相应的基因片段扩增的同时进行靶基囚的生物素标记，扩 增的产物与硝酸纤维素膜上的探针进行杂交。酶联、显色后根据芯片扫描仪的判读结果米确定奶牛乳房炎 致病菌感染的种类。结果表明：我们建立的以16SrDNA为对象的基因芯片检测方法，可以快速的检测出 以上6种细菌，整个检测过程需要6～7小时，灵敏度大大提高，特异性较好，能快速的对奶牛乳房炎的 主要致病茁作出诊断。基因芯片用于奶牛乳房炎主要致病菌的检测是一种探索，具有实践意义。 奶牛乳房炎是造成奶牛业经济损失最大的疾病之一，主要由多种致病菌感染引起，它不仅造成重大的 经济损失，还影响到乳的品质，危及人的健康。常规的检测方法是根据不回致病菌的生物学特性，采用不 同的培养基和培养方法，检出可疑的致病菌，再用生化反应、血清学试验、噬菌体裂解试验等方法加以鉴 定。但由于临床用药等原因．细菌培养常常阴性， 并且传统的检测方法操作繁琐．费时费力。PCR法快速、灵敏，但假阳性率高，且一次只能检测一种 病原菌。本文采用了近年来才迅速发展起来的高新技术—基因芯片进行奶牛乳房炎主要致病菌的检测。基 因芯片有其高通量、快速、灵敏的特点．它打破了传统的‘‘一对一的检测思路，一次可同时检测多种致病 菌。 基因芯片技术【”31是一种反向固相杂交技术，具有微型化、高通量、并行处理、易于自动化等优越性。 基因芯片又称DNA微阵列。是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的很多核酸分子所组成的微 点阵阵列。它以在细菌分类学上具有重要意义的16SrDNA为主要靶基因．设计～套用于检测和鉴定不同 属种的寡核苜酸探针，探针以一定方式固定在硝酸膜上。制成基因芯片，利用通用引物对靶基因扩增和标 记之后，扩增产物与基因芯片在适当条件下杂交，根据杂交结果就能达到鉴别细菌属种的目的。本研究中， 我们选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎 主要致病菌为研究对象，设计了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针及无乳链球菌、停 乳链球菌、乳房链球菌三种链球菌的共有探针，由于16SrDNA的序列保守性，三种链球菌在通用引物 扩增的基因片段内序列几乎完全相同，因此我们又设计了三种链球菌的特异引物，并用这三种特异引物扩 增的片段的纯化产物作为这三种链球菌的检测探针，实现了对三种链球菌的鉴别。 1材料 1．1菌株朱源： 无乳链球菌、金黄色葡萄球菌购白中国兽医药品监察所，大肠杆菌、绿脓杆菌由山东澳兰百特生物工 程研究院保存，停乳链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌由山东农业大学赵宏坤教授惠赠。 1．2培养基： 无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌采用胰蛋白胨、大豆胨培养基，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、 大肠杆菌用LB固体或肉汤。 1．3主要试剂、仪器和设备： dNTPs购自Promega公司，TaqDNA聚合酶、10‘PCR 998 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 一 交仪、扫描仪均为自行设计委托厂家制造，台式高速冷冻离心机由军事医学科学院研制，DA620s型紫外 分光光度计为棱光公司产品。硝酸纤维索膜购自北京化工大学。、 1．4引物的设计和合成： 利用DAMBE软件对检索得到的相关的16SrDNA序列进行序列对齐，得到碱基对齐图和聚类分析的 结果。根据碱基对齐图划分出16SrDNA的恒定区和可变区．并根据查阅文献，筛选出针对真细菌特异性 海赛百盛生物工程公司合成。 序 说明 探针序列