质粒制备绝对定量pcr标准曲线方法的建立establishmentofthe.pdfVIP

农业生物技术学报，  年， 第  卷， 第  期， 第  页  2011 19 6 1157~1162 Journal ofAgriculturalBiotechnology,2011,Vol.19,No.6, 1157~1162  技术改进  UpdatedTechnology  质粒制备绝对定量 PCR 标准曲线方法的建立 李丽 赵成萍 李宏 李武峰 张利环 许冬梅 王金胜 李慧锋 *  ,  030801  山西农业大学生命科学学院 太谷 * lihuifengtom@  通讯作者，  摘 要 用质粒制备绝对定量 PCR 标准曲线存在着作为标准品的双链环状质粒分子与待测样品单链线性  cDNA 分子结构不一致的问题。 为了消除二者之间的差异， 确保绝对定量 PCR 测定方法的准确性， 我们在用质 粒制备标准曲线和测定未知样品中特定基因  分子拷贝数时进行了两个改进： 用酶切的方法使环状质 mRNA 1) 粒线性化， 用线性质粒制备标准曲线； 将未知样品  扩增出一条正义链， 再与作为标准曲线的质粒标准 2) cDNA 品同时开始荧光定量 循环。实验结果表明， 具有相同拷贝数的环状和线性质粒在一起进行定量  测 PCR 1) PCR 定时， 环状质粒所得的 Ct 值大于线性质粒所得的 Ct 值 P ； 本研究测定的  样品中先扩增一次测 ( 0.05) 2) cDNA 出的起始拷贝数均大于未先扩增一次的测定结果。样品起始拷贝数两次测定结果的差异分析表明  个样品中 5 有  个样品的测定差异达到了显著水平 P  。应用该方法改进的鸡 GA TA 5 基因绝对定量  的标准曲 3 ( 0.05) PCR  线能够准确地反应目的产物扩增。经改进的质粒制备绝对定量 PCR标准曲线的方法更为简便易行， 并提高了 测定的准确性。 关键词 质粒， 标准曲线， 绝对定量 PCR  Establishment of the Plasmid Standard Curve Generation Method for  Absolute Quantification PCR  *  LiLi  ZhaoChengping  LiHong  LiWufeng  ZhangLihuan  Xu Dongmei  WangJinsheng  LiHuifeng  ShanxiAgriculturalUniversity,CollegeofLife Sciences,Taigu 030801,China  *Correspon