半巢式pcr法构建天然噬菌体单域重链抗体文库.pdfVIP

※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 19 299 PCR 涂 追 1,2 ，许 杨 1,2, * ，何庆华1,2 ，陶 勇2 (1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047 ；2.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌 330047) ：目的：构建天然噬菌体单域重链抗体文库，淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法：以未 经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料，提取 RNA 反转录为 cDNA ，根据重链抗体保守序列设计引物， 通过半巢式 PCR 法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因，将其克隆至噬菌粒pHEN1 ，电转化大肠杆菌TG1 得到 初级抗体库，辅助噬菌体 KM13 感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对 3 种人工抗原进行淘选。结果： 7 单域重链抗体编码基因得到有效扩增，经 10 次电转化获得初级文库，命名为 SNAL，实际库容量达到 1.6 ×10 个 独立克隆，菌落 PCR 鉴定结果表明，克隆效率约为 87% ，辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为 SNA-PDL ， 滴度达 1013CFU/mL 。对3 种不同人工抗原 DON-MBSA 、NOR-BSA 和 AFB 1-OVA 的淘选均有富集现象。结论： 构建了天然噬菌体单域重链抗体文库，文库的多样性较好，可以用于后续淘选。 单域重链抗体；V H H 抗体；噬菌体文库；羊驼；半抗原 Construction of Alpaca-derived Naive Single-domain Antibody Phage Display Library by Semi-nested PCR TU Zhui1,2 ，XU Yang 1,2,*，HE Qing-hua 1,2 ，TAO Yong2 (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China ； 2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China) Abstract ：Objective: To construct a single-domain heavy chain antibody phage display library for food safety detection. Methods: Total RNA was purified from peripheral lymphocytes of two healthy non-immune alpaca (Lama pacos) and directly used for complementary DNA (cDNA) synthesis. The repertoire of VHH encoding DNAs was amplified by semi-nested PCR, and the PCR products were cloned into the phagemid vector pHEN1. Through the electroporation of E. coli TG1, a primary library was established and then rescued by the helper phage KM13 to generate a phage display librar