大肠杆菌中从头合成白藜芦醇途径的设计及优化-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（２）：７１７７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 大肠杆菌中从头合成白藜芦醇途径的设计及优化 １，２ １ ２ 汪建峰 　张嗣良 　王　勇 （１华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室　上海　２００２３７） （２中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室　上海　２０００３２） 摘要　白藜芦醇是一种极具药用价值的植物源芪类化合物。为了在Ｅ．ｃｏｌｉ实现白藜芦醇的从头 合成，构建了由酪氨酸解氨酶（ＴＡＬ），香豆酸ＣｏＡ合成酶（４ＣＬ）和白藜芦醇合成酶（ＳＴＳ）组成的 非天然合成途径。经３天发酵后，白藜芦醇产量仅为２．６７ｍｇ／Ｌ，而其中间体香豆酸的积累达到 了９５．６４ｍｇ／Ｌ。为了进一步改善异源途径的效率，对４ＣＬ和ＳＴＳ模块采取融合表达、高拷贝表达 及启动子工程改造的策略，最终使白藜芦醇产量提高到了９．６倍，达到了２５．７６ｍｇ／Ｌ，同时香豆 酸的积累减少到了２０．３８ｍｇ／Ｌ。这些研究结果为更高效白藜芦醇从头合成工程菌的构建及最终 实现白藜芦醇的微生物大规模生产奠定了基础。 关键词　大肠杆菌　白藜芦醇　融合表达　高拷贝表达　启动子工程 中图分类号　Ｑ８１９ 　　白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）是一种重要的芪类（ｓｔｉｌｂｅｎｅｓ） ４ＣＬ和ＳＴＳ下游模块结合外源添加香豆酸前体的方 化合物，广泛存在于葡萄，虎杖等植物中。研究表明白藜 法，在Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ成功地合成了各种芪类／ ［６１１］ 芦醇是一种极具潜力的天然药物，具有预防心血管、抗肿 黄酮类化合物 。但该方法受到化学合成法生产香 ［１］ ［１２］ 瘤、延长寿命等多种重要的生理活性 。目前白藜芦醇 豆酸成本高，环境污染大的因素的限制 。随着越来 的生产主要依赖于植物组织抽提，但受到成本高、得率 越多芳香族氨基酸解氨酶的发现，通过表达外源酪氨 低、植物资源有限等因素的影响，远远无法满足市场需 酸解氨酶（ＴＡＬ）的方法，使Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ能直 ［２］ 接利用内源酪氨酸合成香豆酸中间体，为芪类／黄酮类 求 。随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步， 在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主中设计与构建高效的异源 化合物的微生物从头合成奠定了基础［１３１５］。Ｗａｔｔｓ ［１３］ 合成途径，结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇 等 将浑球红细菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）来源的ｔａｌ 等植物源珍稀天然产物工业化生产的重要方法［３５］。 基因引入到了Ｅ．ｃｏｌｉ中，首次实现了柚皮素在Ｅ．ｃｏｌｉ中 ［１４］ 　　与重要的黄酮类化合物柚皮素（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）类似， 的从头合成。近来Ｓａｎｔｏｓ等 采用了各种不同来源的 白藜芦醇在植物体中主要以苯丙氨酸和丙二酰ＣｏＡ为 途径模块，利用模块化的策略对Ｅ．ｃｏｌｉ工程菌进行系统 前体，由苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、肉桂酸羟 改造，使柚皮素的产量达８４ｍｇ／Ｌ。较之柚皮素，目前针