巢式pcr快速检测西瓜细菌性果斑病菌-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(2):284-291 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.008 巢式PCR 快速检测西瓜细菌性果斑病菌 王 婧，毕 阳，朱 艳，韩舜愈，祝 霞，盛文军，李 敏 （甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州730070 ） 摘要：【目的】建立nested-PCR 方法，快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac ），为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon，WFB ）的防控提供技术支持。 【方法】根据Aac BOX 短重复序列的PCR 产物设计两对引物BX-L1/BX-R5 和BX-L1/BX-S-R2，建立以BX-L1/BX-R5 为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2 为内侧引物的nested-PCR，以5 µL 样品处理液于99℃高温裂解10 min，再放置冰 上冷却5 min，以所释放病原DNA 为模板进行PCR 扩增，采用50 μL 反应体系：5 μL 10 ×PCR buffer （25 mmol∙L-1 -1 -1 MgCl ），4 μL dNTP （D4030RA，2.5 mmol∙L ），引物（5 μmol∙L ）各3 μL，0.4 μL Taq DNA 酶（DR001B，5 U∙ 2 -1 μL ），通过退火温度优化，反应条件为：引物BX-L1/BX-R5 各 3 μL 进行第一轮扩增，95℃，2 min；95℃，30 s； 65℃，45s；72℃，1 min；35 个循环；72℃，延伸7 min；取扩增后的产物1 μL 为模板，以引物BX-L1/BX-S-R2 各 3 μL 进行第二轮扩增，95℃，2 min；95℃，30 s，66℃，45 s，72℃，1 min，30 个循环，72℃，7 min。在 此条件下对梯度Aac 菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验，对不同带菌率的西瓜种子 提取液进行检测。 【结果】引物BX-L1/BX-R5 和BX-L1/BX-S-R2 在检测不同来源的Aac 菌株时都产生了预期大小 的片段，并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae ）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci ）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以 BX-L1/BX-R5 为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2 为内侧引物的 1 nested-PCR，对Aac 纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7 ×10 cfu/mL，比direct-PCR 灵敏度高出1 000 倍。当西瓜种子带菌率在0.1%—0.5%时，nested-PCR 阳性检测率为66.7%；当种子带菌率为1%—10%时，nested-PCR 的阳性检测率为83%—100%。 【结论】以BX-L1/BX-R5 为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2 为内侧引物的nested-PCR 方 法，能够快速、高效检测携带微量Aac 的西瓜种子，检测结果重现性高。 关键词：西瓜细菌性果斑病；西瓜种子；PCR；检测 Nested-PCR Rapidly Detecte Acidovorax avenae subsp. citrulli from Watermelon Seeds WANG Jing , BI Yang , ZHU Yan, HAN