第06章 酶分子修饰.ppt

五、酶蛋白化学修饰的局限性 1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。 2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。 3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。 4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。 第二节 酶分子的物理修饰 通过物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 变性、诱导与构象重建 （对酶高级结构调整） 酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理。 实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然Rnase（核糖核酸酶）,其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失，但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，RNase活力全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同。 第三节 蛋白质工程和酶的定向进化 （基因水平上进行蛋白质改造） 蛋白质工程——以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系，也是在基因水平进行蛋白质改造的技术科学。 一、酶蛋白质工程 1、蛋白质工程的主要目标 (1) 功能的改变 (2) 结构特性的改变 (3) 新体系的创造 2、酶蛋白质工程所需基本信息 酶的基因克隆 ; 该基因的序列 ; 活性部位的作用机理 , 更理想的是涉及活性部位的氨基酸 ; 酶的晶体结构, 或者至少是同源性很高的蛋白质空间结构。 3、酶蛋白质工程的流程 相关的序列及 3D 结构数据库 4、酶蛋白质工程的前景 酶的蛋白质工程是典型的多学科综合研究 , 所涉及的学科不仅有酶学、蛋白质化学和分 子生物学 , 而且还涉及蛋白质结构解析和生物信息学分析。 在对于天然的蛋白分子的研究还未总结出可以基本涵盖绝大多数情况的结构与功能的规律之前 , 酶的蛋白质工程不可能成为主要的创造新酶源的手段。 酶的蛋白质工程将创造出大量具有新的、功能更好的酶产品，蛋白质工程对于分子性能的改善程度和功能创新的多样性, 将会超过现在最具想像力的预测。 二、酶的定向进化 1、定向进化的原理 2、定向进化示意图 3、定向进化不是定点突变 4、酶体外定向进化的意义 1、定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’-5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质) 。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+定向选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 2、定向进化示意图 随机突变+定向选择＝目标突变体 细菌 诱发突变的因素 50 0C培养 突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突变体 最适生长温度为370C 最适生长温度提高了！ 3、随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling) 随机引发重组 交错延伸技术 4、定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 5、酶体外定向进化的意义 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合