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应力环境下破骨细胞碳酐酸酶Ⅱ基因表达 　　[摘要] 目的 研究流体切应力条件下大鼠破骨细胞碳酐酸酶Ⅱ（CaⅡ）mRNA的表达变化，探讨应力环境下大鼠 破骨细胞的功能活动情况。方法 采用1，25-（OH）2D3/地塞米松诱导SD大鼠骨髓细胞，抗酒石酸酸性磷酸酶染色和扫描电镜鉴定破骨细胞，0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）进行细胞纯化。对破骨细胞施加不同力值和作用 时间的流体切应力，采用实时荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测CaⅡ mRNA的表达。结果 随着力值的增加和作用时间的延长，破骨细胞CaⅡ mRNA的表达量分别呈下降趋势（P 　　tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测CaⅡ mRNA的表达水平，探讨应力环境下大鼠破骨细胞功能活动的变化情况。 1 材料和方法 1.1 材料 SD大鼠（清洁级，贵阳医学院动物中心提供）； α-MEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Hy-clone公司，美国）；地塞米松、1，25-（OH）2D3、青霉素-链霉素（Sigma公司，美国）；Trizol Reagent、 SupperScript Ⅱ逆转录试剂盒、DNase Ⅰ（Invitrogen公司，美国）；聚合酶链反应（polymerase chain reac-tion，PCR）试剂（MBI公司，立陶宛）；引物及Taqman荧光探针（上海闪精生物制剂有限公司）。 CO2恒温培养箱、细胞培养箱（Sanyo公司，日 本）；倒置相差显微镜（OLYMPUS公司，日本）；除 菌过滤器（Gibco公司，美国）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；FTC2000荧光定量PCR仪（枫岭公司，加拿大）；流体切应力加力系统 （专利号：200420034438）。 1.2 方法 1.2.1 破骨细胞的原代培养、鉴定和纯化 以1，25-（OH）2D3/地塞米松诱导10～12 d龄SD大鼠四肢长骨骨髓细胞，培养第7天，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tar- trate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色[3]和扫 描电镜（scanning electron microscope，SEM）鉴定破骨 细胞，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（ethy- lenediamine tetraacetic acid，EDTA）进行细胞纯化[4]。 1.2.2 破骨细胞的体外加力 按加力时间和力值大小的不同，分为2组，具体如下。1）力值组：分别对纯化后的破骨细胞施加0（对照组）、0.9、3.2、8.9、 18.7 dyne·cm-2的流体切应力，时间为30 min；2）时 间组：分别对纯化后的破骨细胞施加3.2 dyne·cm-2的流体切应力，时间各为0（对照组）、15、30、60 min。 每组实验进行3次。呈单层排列的细胞受到切应力的计算公式为[5]：τ=6μQ/wh2。其中μ为培养基表观黏 度，Q为流量，w为流槽宽度，h为流槽高度。由血液流变仪测出α-MEM培养基37 ℃时μ=0.752×10-3 Pa·s。在实验加力结束时用秒表和量筒测量培养基流量。 将流体切应力加力装置[6]按设计要求安装。系统中加入无血清的α-MEM培养液（37 ℃）200 mL，启动 蠕动泵，保持蠕动泵提供的流量恒定（约50 mL·min-1）。培养7 d的破骨细胞纯化后，将载玻片放入流室的矩形流槽内，按分组情况分别对纯化后的破骨细胞施加流体切应力。 1.2.3 实时荧光定量巢式RT-PCR 采用Trizol法提取样本总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行检验。利用cDNA反转录试剂盒建立反应体系，合成cDNA。根据Genebank中检索到的CaⅡ mRNA基因全序列，结合标准荧光定量PCR引物设计原则，进行CaⅡ mRNA内、外侧引物和管家基因GAPDH的Taqman探针的设计（表1）。引物和探针由上海生物公司合成并检测。将cDNA产物进行巢式PCR，第一轮PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，循环15次；72 ℃延伸5 min。第二轮PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，循环35次；72 ℃延伸 5 min。对第二轮PCR产物进行2%琼脂糖电泳，检验引物设计合成无误后，进行实时荧光定量PCR，反应体系为：10×PCR缓冲液3 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL