油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的克隆与表达分析-中国农业科学.PDFVIP

中国农业科学 2017,50(10):1914-1921 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.10.016 油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因 FAD3 的克隆与表达分析 黄兴琳，陆俊杏，廖冰楠，白辉扬，管丽，张涛 （重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331 ） 摘要： 【目的】ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)为植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶，通过对油用牡丹‘凤 丹’ω-3 FAD 基因结构特征及其在不同组织中的表达模式进行分析，为研究 FAD3 在油用牡丹‘凤丹’脂肪酸形 成过程中的调控提供理论基础。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹 ‘凤丹’ω-3 FAD基因，用Vector NTI Advance 11 软件进行序列分析，BLAST 进行同源性比较，并用 MEGA7.0 的邻接法（neighbor-joining，NJ） 构建系统进化树，利用在线蛋白质分析工具ExPASy预测FAD3蛋白的基本参数和特性，利用Phyre2预测蛋白质二 级和三级结构，并通过实时荧光定量 PCR 检测该基因在油用牡丹‘凤丹’不同发育期的种子以及不同组织中的特 异性表达情况。【结果】获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶 FAD3，命名为FAD3 （GenBank登录号：KX906966）。 序列分析表明该基因 cDNA 序列全长 1 723 bp，其中，开放阅读框 1 308 bp，编码 435 个氨基酸，3′端非编码区 长287 bp，5′末端非编码区长99 bp，预测成熟蛋白分子量为49.9 kD，理论等电点（pI ）为7.42，N端无信号肽， 脂肪系数为83.08，不稳定指数35.67，总水平亲水性为-0.222。经FAD3 蛋白的二级结构预测，FAD3以α-螺旋、 随机卷曲为主，其次是延伸链、β-转角含量较少；多序列比对结果表明，油用牡丹 FAD3 氨基酸序列含有 2 个保 守结构域，系统发育分析结果显示‘凤丹’与芍药处于同一分支，其亲缘关系最近。TMHMM 和 TargetP 亚细胞定 位分析得知，FAD3蛋白有3个跨膜区域，可能定位于内质网中发挥功能。组织特异性结果分析表明，FAD3 在‘凤 丹’的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达，其中，在叶中表达量最高，雌蕊次之，在雄蕊中表达 量最低；不同时期种子中，10 d 表达量最高，20 d 次之，在 60 d 中表达量最低。【结论】成功从油用牡丹‘凤 丹’中克隆获得 FAD3 全长cDNA序列，其在‘凤丹’不同组织中呈现出多种表达模式。 关键词：油用牡丹；脂肪酸脱氢酶；克隆；实时荧光定量PCR Cloning and Expression Analysis of Fatty Acid Desaturase Gene FAD3 from Oil Peony HUANG XingLin, LU JunXing, LIAO BingNan, BAI HuiYang, GUAN Li, ZHANG Tao (College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331) Abstract: 【Objective 】 The Omega -3 fatty acid desaturase (ω-3 FAD) is a key enzyme in the fatty acid biosynthesis pathway of plant. Through analysis of omega-3 fatty acid desaturase gene structure and its expression in different tissues from Paeonia ostii, this study will lay a foundation for the